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1、新品介绍 蚕 丝 素 蛋 白 及 其 应 用王佳培 ? 胡建恩 ? 白雪芳 ? 杜昱光?( 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023)摘? 要: 阐述了丝素蛋白的组成、 结构、 性质和制备方法, 及其综合利用现状。丝素作为一种天然蛋白质在医学和食品等行业中的应用开发研究具有深远的意义。 关键词: 丝素蛋白; 蚕丝; 氨基酸Silk Fibroin and its ApplicationWANG Jia?pei, H UJian?en, BA I Xue? f ang, DU Yu? guang(Dalian Institute of Chemical Physics, Chin
2、ese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)Abstract: The composition, structure, property, preparation and current situation of comprehensive utilization of silk fibroin have been reviewed in this paper. The development research on application of silk fibroin, a kind of natural re?source, in medi
3、cine, foodstuff and otherwise has great profound significance in practice. Key words: silk fibroin; silk; amino acid? ? 蚕丝由 2 种蛋白组成, 包围在蚕丝外层的是丝胶蛋白, 内层为丝素蛋白。不同种类的蚕丝中, 丝素蛋白的含量不尽相同, 但大体上说, 丝素蛋白占蚕丝 总质量的 70% 80% 。我国早在 5000 年前就有了养蚕的历史, 历来以养蚕?缫丝?织绸为传统产业, 是产丝大国, 家蚕蚕茧 和年生丝量分别为 68 万 t 和 8?7 万 t, 占全世界总产量的 70%1
4、!; 柞蚕的总产量占全世界的 90% 左右。在丝绸生产过程中难免产生废丝, 其数量可观,从资源节约和综合利用方面出发, 开展对丝素的开 发研究有着重要的意义。1? 组成和结构1?1? 组成丝素蛋白由 18 种氨基酸组成, 其中有 8 种是人体所必需的氨基酸。由于种类的不同, 柞蚕丝和桑蚕丝的丝素蛋白中氨基酸含量具有明显的差别, 详 见表 1。表 1? 柞蚕丝和桑蚕丝的氨基酸组成 2!%名? ? 称柞蚕丝素桑蚕丝素甘氨酸25?8542?8丙氨酸44?1132?4缬氨酸1?523?03亮氨酸0?400?68异 亮 氨 酸0?380?87丝氨酸12?914?7苏氨酸0?471?51蛋氨酸0?500?
5、10胱氨酸0?230?03酪氨酸9?0111?8苯 丙 氨 酸0?471?15脯氨酸0?470?63色氨酸1?750?36赖氨酸0?210?45精氨酸5?130?90天门冬氨酸8?221?73谷氨酸2?121?74组氨酸1?560?3213?收稿日期: 2004 ?05 ?17? ? ? ? 作者简介: 杜昱光( 1963?) , 男, 研究员, 中国科学院大连化学物理研究所天然产物与糖工程研究组负责人, 从事植物 糖生物学与寡糖工程天然产物研究、 应用微生物研究与开发。? 第 12 卷第 12 期精细与专用化学品Vol. 12, No. 12? 2004 年 6 月 21 日Fine and
6、 Specialty Chemicals除了碳、 氢和氮元素外, 丝素蛋白还含有多种其他元素如钾、 钙、 硅、 锶、 磷、 铁、 铜等, 这些元素与丝素蛋白的性能及蚕吐丝的机理等有直接关系 1!。1?2? 结构 丝素蛋白是一种纤维状蛋白, 由表层的无定形区和里层的结晶区构成。其中结晶区包括 2 种结晶形态, 分别称为 silk #型和 silk 型。silk # 晶体立 体构象呈曲柄形, 是介于 ? ?折叠与 ? ?螺旋之间的一种中间形态, 晶胞参数为: a= 4?49?, b= 7?20?, c=9?08?; silk 晶体呈反平行 ? ?折叠层结构, 属单斜晶系, 晶 胞参 数为: a =
7、 9?44?, b = 6?97?, c = 9?20?, ?= 90%, 由肽链构成折叠层, 再由折叠层形成整个silk晶体 3!。在silk 中, 肽链的链段排列整齐, 相邻链段之 间的氢键和分子间引力使它们结合的相当紧密, 抵抗外力拉伸的能力强, 柔软度低, 在水中难以溶解,对酸、 碱、 盐、 酶及热的抵抗力较强。无定形丝素中肽链的链段排列不整齐, 链段之间的结合力较弱, 易 溶于水, 柔软度高, 抵抗外力拉伸的能力弱, 吸湿性强, 对酸、 碱、 盐、 酶和热的抵抗力较弱。在透射电镜和扫描电镜下观察 4!, 丝素纤维的 最基本结构单元是直径为 10 50nm 的微原纤, 微原纤聚集成数万
8、纳米的原纤, 大约 100 根原纤再集合成十万纳米数量级的巨原纤, 巨原纤再聚集成几百万纳米的丝素纤维。 近年来, Regina?V 等人又发现了存在于丝素溶液 ?空气界面上的一种新的丝素结晶形态, 称之为silk 温度高于 45 时, silk #向 silk 转变。丝素溶液干燥固化后的结构不但受温度影响, 还与干燥速度、 溶液的酸碱度及组成有着密切的关系。长时间常温下干燥的过程中有 silk #的形成, 但最终会 形成稳定的 silk ; 当干燥速度过快时, 即使在 50以上, 仍以无定形结构为主; 若溶液干燥初期 pH 值大于 5, 则形成无定形结构; 若溶液干燥初期 pH 值 小于 5
9、, 则形成 silk ; 若丝素水溶液中加入甲醇、 乙醇等溶剂, 则形成 silk ; 另外, 将丝素水溶液搅拌或将固态丝素快速拉伸, 则形成 silk ; 将丝素水溶液放置于 7kV 的电场中时, 部分带极性的链段在电 场的作用下定向排列, 使丝素构象形成 silk 。由此我们可以看出, 丝素溶液在受到外界刺激时, 很容易形成其比较稳定的结构形态 silk 。有些金属离子对丝素蛋白的构象有一定的影 响。在一定 pH 值条件下, Ni2+离子通过四配位的螯合作用诱导丝素蛋白 silk的形成; Viney 根据电感耦合等离子体( ICP) 技术推测 Ca2+的增加能使 silk 的形成加速; 李
10、贵阳等用 NMR 谱定量拟合的结果表明, Ca2+、 Cu2+的存在有利于 silk 的形成 9!; Paola Taddei 发现 Co2+的配位作用也对丝素蛋白的结构有着一定的影响 10!。3? 制备提取丝素蛋白的途径主要有 2 种: ? 从五龄蚕 的丝腺中直接获得丝素蛋白 11!; ( 从天然蚕丝或茧壳中提取丝素蛋白。由于从蚕的丝腺中提取丝素蛋白的操作难度比较大, 所以在需要大量制备丝素蛋14精细与专用化学品第 12 卷第 12 期白的情况下, 人们多数采用第二种方法, 即从天然蚕丝中提取丝素蛋白。从天然蚕丝或茧壳中提取丝素蛋白分为 2 个步 骤: 蚕丝或茧壳的脱胶和丝素纤维的溶解。3?
11、1? 脱胶( 1) 马赛热皂液法( Marseilles soap) 把干燥的桑蚕茧壳放入 0?5% 的马赛热皂液和0?3% 的 Na2CO3混合液中, 在 100 下煮沸 1h, 再用去离子水冲洗数次, 即得到丝素纤维 12 13!。 Paola T addei 等人对于不同种类的蚕壳采用了不同的方法: 家蚕蚕壳在 7g/ L 的马赛热皂液中, 98 下加热 1h; 柞蚕蚕壳在 3g/ L Na2CO3、 3g/ LNa2SiO3和 2g/ L 马赛热皂液的混合液中, 在 98 下加热 1h。( 2) Na2CO3脱胶法 用Na2CO3脱胶有 3 种操作方法: ? 在 0?05%Na2CO3
12、溶液中于 98 100 下加热 30min, 重复 3次; ( 在 0?05% Na2CO3溶液中, 脱胶液的体积( 单位为毫升) 与蚕壳的质量( 单位为克) 之比为 50, 煮沸 60min, 重复 2 次14!; ) 在 0?5% Na2CO3溶液 中, 脱胶液的体积( 单位为毫升) 与蚕壳的质量( 单位为克) 之比为 50, 煮沸 30min, 重复 2 次15!。脱胶后用苦味酸胭脂红溶液来检测精炼丝是否 脱胶完全, 样品呈黄色表明丝胶脱尽, 红色表明丝胶尚未脱尽; 也可以用 0?5% 的 NaHCO3煮沸 30min 进行脱胶, 重复此操作一次后, 用去离子水洗净, 得到丝素纤维16!
13、。( 3) 酶解脱胶法 将蚕 壳 或 蚕 丝 放 入 1% Alkalase 浓 度 为2?5mg/ mL 的溶液中, 在 60 下煮 30min, 其中脱胶液的体积( 单位为毫升) 与蚕壳的质量( 单位为克) 之 比为 50。( 4) 尿素脱胶法脱胶液为 8mol/ L 尿素溶液、 0?04mol/ L T ris 和 硫酸盐缓冲液( pH= 7) 、 0?5mol/ L 巯基乙醇的混合溶液, 其中脱胶液的体积( 单位为毫升) 与蚕壳的质量( 单位为克) 之比为 30。 ( 5) 皂液脱胶法将茧壳或蚕丝放入 0?05% 的皂液中, 在 100 下煮 30min, 其中脱胶液的体积( 单位为毫
14、升) 与蚕 壳的质量( 单位为克) 之比为 100。( 6) 水脱胶法将茧壳或蚕丝放入 100 的水中, 常压下煮 560min, 或用高压灭菌锅在 120 下煮 5 30min, 其中脱胶液的体积( 单位为毫升) 与蚕壳的质量( 单位 为克) 之比为 30。3?2? 丝素纤维的溶解( 1)Ajisawa s 法17!将脱胶后的丝素纤维放入 Ajisawa s 试剂 n( CaCl2)+ n( EtOH) + n( H2O) = 1+ 2+ 8!中, 在75 下不断搅拌, 直至丝素纤维全部溶解, 其中, 丝素纤维的体 积( 单位为毫升) 与 Ajisawa s 试剂质量( 单位为克)的比为 1
15、5。溶解液用去离子水透析, 直到用 AgNO3检测不到 Cl-为止。Ajisawa s 法的溶解温度和时 间可根据反应情况和要求进行适当的调节。用40%的高浓度 CaCl2溶液也能将丝素蛋白溶解, 溶解后蛋白的分子量分布与加热时间有关。 ( 2) LiBr 溶解法LiBr 溶解法的溶解液可分为 3种:? m( LiBr)+ m( C2H5OH) + m( H2O) = 45+ 44+ 11; ( m ( LiBr) + m( C2H5OH) = 40+ 60; ) 9?5mol/ L 的 LiBr?H2O 溶液。( 3) LiSCN 溶解法方法一: 将脱胶蚕丝放入 9mol/ L 的 LiSC
16、N 溶 解液中不断搅拌, 直至溶解, 丝素纤维的体积( 单位为毫升) 与 Ajisawa s 试剂质量( 单位为克) 的比为30 100 , 得到的丝素溶液用水或 5mol/ L 的尿素透 析 2h。方法二: 将脱胶蚕丝放入60%的 LiSCN 溶解液中不断搅拌, 直至溶解, 丝素纤维的体积( 单位为毫 升) 与Ajisawa s 试剂质量( 单位为克) 的比为 100,丝素溶液用 20mmol/ L Tris?HCl 和 5mol/ L 尿素的混合液透析。由于 LiSCN 在中性、 室温的条件下即可把丝素溶解, 不引起肽键的水解, 所以它是一种比 较理想的溶解试剂。除了 LiSCN 外, NaSCN 18!、 十二烷基磺酸锂也是很好的丝素溶解液。有报道 LiCl/ N , N?二甲基 乙酰胺在室温条件下对丝素的溶解非常好, 而且完全溶解仅需 1 2h 18 !。 ( 4) Ca( NO3)2溶解法将脱胶蚕丝放入 Ca( NO3)2?MeOH?H2O 的体系中, m Ca( NO3)24H2O!+
