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1、江南大学食品学院微生物学江南大学食品学院微生物学 97-07 年硕士研究生试题汇编及简答年硕士研究生试题汇编及简答 作者：作者：babybath 97 硕士题硕士题 1如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明； 见练习题第 19 题,周德庆二版教材 P144 考察知识点，代谢调控理论，周德庆二版上的内容；应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节；应用抗 反馈调节菌株解除代谢调节 答：为了使大量积累中间代谢产物或终产物，必须破坏或解除原有的调控关系并建立新的调节机制，使它 按照人们的意愿使目的产物大量生成和积累 （一）调节初生代谢途径 微生物
2、细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位 以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等，其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括调节酶的合 成和调节现成酶分子的催化能力，两者密切配合，以达最佳效果。在发酵工程业中常通过三种调节初生代 谢途径而提高发酵生产率 (1) 应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节 营养缺陷型菌株丧失了某种酶合成能力，只有在加有该酶的培养基中才能生长，在直线型的合成途径 中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物，但在分支代谢途径中，通过解除某种 反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。 如高丝氨酸营养缺陷型
3、菌株由于该菌株不能合成高丝氨酸脱氢酶因此不能生产高丝氨酸脱氢酶，也不 能产苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸（或苏氨酸和蛋氨酸）的条件下突变株可以在含高浓度糖和 铵盐的培养基中产生出大量赖氨酸。 (2) 应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节 此菌株对反馈抑制不敏感，或对阻遏有抗性，或兼而有之的组成菌株。这类菌株其反馈抑制或阻碍已 解除，故可分泌大量末端代谢产物。抗反馈调节的突变株可从结构类似物抗性突变菌株和营养缺陷型回复 突变株中获得。结构类似物抗性突变株的末端产物合成酶系的结构基因发生了突变，故不再受末端产物的 反馈抑制，于是末端产物就大量积累，利用结构类似物作筛子，可筛选其对应氨基酸的高产
4、株 以赖氨酸发酵为例,谷氨酸棒杆菌对赖氨酸的结构类似物 S-( 氨乙酰基)胱氨酸(AEC)敏感,是赖氨酸毒 性类似物。它能抑制合成途径中的天冬氨酸激酶,但不能参与蛋白质的合成。当细胞在含有 AEC 的培养基 中培养时,野生型菌株由于得不到赖氨酸营养而遭淘汰,抗 AEC 突变型则因编码天冬氨酸酶结构基因发生了 突变,变构酶调节部位不再能与代谢拮抗类似物相结合,而其活性中心却不变,这种突变型在正常代谢时,最 终产物与代谢类似物结构相似,故也不与结构发生改变的变构酶相结合,这样,这种抗反馈调节突变型对产物 抑制脱敏,仍有正常的催化功能,从而过量生产赖氨酸。 （3）控制细胞膜的渗透性 改变细胞膜的透性
5、，使细胞内的代谢产物迅速渗透到细胞外，以解除末端产物反馈抑制作用， a. 通过生理学手段控制细胞膜的渗透性 例如在谷氨酸发酵生产中,在谷氨酸生产菌的细胞生长期加入添加适量青霉素，可抑制细菌细胞壁肽聚糖 合成中的肽链交联，造成细胞壁的缺损，有利于代谢产物生物素外泄，降低了谷氨酸的反馈抑制提高谷氨 酸产量 b. 通过细胞膜缺损突变控制其渗透性 应用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中也因能细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产 量。原因是油酸是一种含有双键的不饱和脂肪酸是细菌细胞膜磷脂中的重要脂肪酸，其油酸缺陷型突变株 因其不能合成油酸而使细胞膜缺损。 （二）控制发酵条件 （1）控制培养基
6、营养成分的组成，浓度配比和 PH 实质上是利用 M 本身固有的代谢调节系统来改变其代谢方向， 使之朝着人们希望的方向进行， 如酿酒 酵母在中心和酸性条件下将葡萄糖发酵产生乙醇和 CO2，而在碱性条件下，产物就会主要变成甘油，而培 养基中的 C/N 比很重要，N 源过多，使微生物生长过于旺盛，而不利于产物的累积，N 源不足，限制了微 生物的生长速度和生长量，也不利于产物的合成 （2）控制发酵温度 温度不仅会影响微生物生长和产物合成的水平，也会影响微生物代谢的途径和方向，如灰色链霉菌嗜 冷突变株在利用烷烃发酵生产抗生素，即使其他发酵条件相同，但发酵温度不同也会使产生的产物完全不 同。 （3）添加诱
7、导物 在培养基中加入适当的诱导物（多为底物或结构类似物）可以增加酶的产量，如木霉发酵生产纤维素 酶时，添加槐糖可以诱导纤维素酶的产生 （4）添加生物合成前体 在色氨酸的合成代谢中，其最终产物的色氨酸对代谢途径中的第一个酶有很强的反馈抑制作用，使色 氨酸的合成受阻，而邻氨基苯甲酸作为前体仅参与色氨酸最后阶段的合成，不受色氨酸反馈抑制的影响， 在培养基中加入邻氨基苯甲酸，虽然色氨酸的反馈抑制还在，但不影响前体的转化，可大幅度提高发酵产 量，在许多次级代谢产物的发酵中，加入前体也可以促进产物的合成，或使之形成特定的产物。 （5）去除代谢产物 反馈抑制是代谢末端产物达到一定量之后会反馈抑制代谢途径中第
8、一个酶的活力，或阻遏第一个酶的 合成从而降低产物生成的能力。因此在发酵中不断去除末端代谢产物，降低其在发酵系统中的浓度，可以 减少反馈抑制，增加产物的产量，可以在发酵过程中采用限量添加这类物质，或改用难以被水解的底物的 办法减少阻遏作用的发生，提高产酶量 2如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？Why？ 练习题第 32 题，本题的知识点系食品微生物范围。 答：食品原料的 PH 值几乎都在 7 以下， 酸性食品：PH4.5（水果） 低酸性食品：PH4.5(蔬菜，鱼，肉，乳) 在酸性食品中，细菌因在过低的 PH 值环
9、境中已受抑制，能生长的仅为乳酸菌，酵母菌和霉菌，因为酵母 菌的最适生长 PH 值为 3.8-6.0.霉菌为 4.0-5.8,芽孢菌不能生长，且霉菌和酵母菌在常压，高温条件下即可 杀死，因此采用高温煮沸的方法即可达到长期保养的目的。 低酸性食品中所有微生物均能生长，细菌生长繁殖的可能性最大，而且能够良好的生长，因为绝大多数细 菌的生长适应的 PH 为 7，当 PH5.5 时腐败细菌已基本被抑制，但有少数细菌仍可生长。且细菌中的芽 孢菌耐高温，因此需要在高温下（大于 100）下持续一段时间以杀死细菌的芽孢。一般 121，20min 杀菌温度： 低酸性食品：高温高压 121。因所有微生物均能生长，芽
10、孢的耐热温度是 120 高酸性食品：沸水 90-100，酸性中酵母菌、霉菌的孢子在 95以上均可以杀死。 3设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主要步骤的基本原理；设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主要步骤的基本原理； 筛选筛选 xx 菌的题目，万能公式菌的题目，万能公式 (1)高温（中温）淀粉酶产生菌的实验方案高温（中温）淀粉酶产生菌的实验方案 (2)果胶酶产生菌的实验方案果胶酶产生菌的实验方案 (3)酸性蛋白酶酸性蛋白酶 (4) 筛选低温乳糖酶产生菌筛选低温乳糖酶产生菌 (5)纤维素酶纤维素酶 答:（1）从高温堆肥中采集菌样（中温淀粉酶从粮食加工厂
11、或者饭店附近的土壤中采样）-用含淀粉液体 培养基增殖（温度 50-60，PH 中性，中温淀粉酶培养温度则为 37左右）-淀粉平板上划线分离或者 涂布（注意点：平板表面不可有水膜或水滴，接种环要光滑，无菌操作）-依据透明圈的大小挑选菌种 （注意点 2,其为淀粉水解圈，越大越好，因为越大则该菌产淀粉酶越多）-再划平板划线分离-模拟工 业发酵进行摇瓶发酵-筛选菌株（初筛，复筛，注意点 3：初筛以量为主，复筛要测定数据的精确度，以 质为主）-测定酶活-鉴定菌株-获得高产菌株 原理，采用淀粉培养基原因：一般细菌不能直接利用淀粉为碳源，而产淀粉酶的菌株可以淀粉酶糖化淀粉 作为 C 源，高温可以杀死一般细菌
12、，只有耐高温的细菌可以存活。 （2）果胶酶： 果园土壤中采集菌样-液体果胶培养基中增值（37）-果胶平板划线分离或涂布（平板表面不可有水 膜或水滴，接种环要光滑，无菌操作）-依据透明圈大小挑选菌株（果胶水解圈越大越好，越大说明菌株 产酶量大）-再划线纯化-模拟工业发酵条件进行摇瓶培养发酵-以后同前面 如果考果胶酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？ 回答如下: 由于果胶酶受阻遏型操纵子的编码调控，则末端产物的反馈阻遏了酶的进一步合成，我们可以应用抗反馈 调节的突变株来解除反馈调节 具体操作:可以把菌样培养在含果胶的结构类似物的培养基上， 该结构类似物能抑制该菌的正常生
13、长时采用 经诱变以后（如 x 射线，亚硝基胍）长出的抗结构类似物的突变株进行发酵就能分泌较多的果胶酶， 由于该突变株的某些酶的结构基因发生了改变，不再受果胶酶的反馈抑制，于是就有大量的果胶酶产生 如果考果胶酶作为一种食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？， 回答如下： 安全性检测：菌种用动物实验测安全性，酶安全性实验，生产过程要符合 GMP 操作，包装原辅料符合生 产安全， 毒性试验: a来自动植物可食部位及传统上作为食品成分或传统上用于食品的菌株所生产的酶，如符合适当的化学 和微生物学要求，即可视为食品，而不必进行毒 性试验 b由非致病性的一般食品污染微生物所
14、生产的酶要求做短期毒性试验 c由非常见微生物所产生的酶要做广泛的毒性实验 （3）酸性蛋白酶 在肉类加工厂，饭店排水沟中的污泥污水中采集菌样-酸性条件下用牛奶作为碳源和氮源-牛奶平板划 线分离-后面与其余相同 原理一般产蛋白酶的细菌不能在酸性条件下生长，酸性条件下可以抑制大量细菌生长，只有产酸性蛋白酶 的细菌可以在酸性条件下利用蛋白质为碳源生长 （4）低温乳糖酶 来源：乳制品厂周围的土壤采集菌样-低温条件下用乳糖作为唯一碳源（15）-乳糖平板划线分离- 后同 耐低温菌株常采用一次性筛选法，将处理过得菌悬液在一定低温下处理一段时间后再分离，对温度敏 感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对低温有较好的耐
15、变性。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。 本题中指示剂用溴甲酚绿，其在酸性条件下呈黄色，碱性环境中呈蓝色，在分离培养基 PH6.8 中加入溴甲 酚绿指示剂后呈蓝绿色，当细菌在该培养基中生长并分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色，菌落周围的培 养基也变为黄色。 （5）纤维素酶：(已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？) 在堆肥，朽木中采集菌样-纤维素液体培养基-纤维素平板划线分离-后面同前 由于纤维素酶受阻遏型操纵子的编码调控，则末端产物的反馈阻遏了酶的进一步合成，我们可以应用 抗反馈调节的突变株来解除反馈调节来提高代谢产物的产量，可用 2-脱氧葡萄糖作为降解产
16、物阻碍物，诱 变处理，定向选育能继续产生葡萄糖的高产菌株，如果发现葡萄糖可继续合成，则已经突破了葡萄糖的反 馈抑制 本题型万能套路：本题型万能套路： （1）先查资料看有无相关报道富集经验 （2）采样，以采集土壤为主（根据分离目的，选择适合该微生物生产的环境进行采集） （3）富集培养 （通过选择性培养基（营养成分，抑制剂添加） ，通过选择一定的培养条件（培养温度， PH 值）来控制，具体可利用微生物利用 C 源的特点，选定待分离微生物的特定碳源，淘汰掉杂菌。 （4）培养分离：采取稀释分离法或平板划线分离法分离单个菌落 （5）筛选：通过菌落形态观察，选出所需菌落，取一半并作鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可移至 试管斜面纯培养，然后采取与生产相近的培养基和条件通过三
