APMV即禽副粘病毒型

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1、Evaluation of the genetic diversity of avian paramyxovirus type 4禽副粘病毒4型基 因多样性的评估Introduction n副粘病毒科病毒已经在世界各地的禽类、 水生和陆生动物中分离出来，而大部分副 粘病毒是从禽类中分离出来的副粘病毒亚 科禽腮腺炎属病毒，因此称之为禽副粘病 毒（APMVs）。nAPMVs分为9个血清型，APMV-1到APMV-9 ，最近APMV-10和APMV-11这两种血清型 分别被发现。Introduction nAPMV-1包含所有NDV的株型，它可以感染 240种鸟类，宿主范围非常广泛。nAPMV-2，

2、-3和-7可以感染鸡和火鸡等笼养 鸟和驯养家禽。nAPMV-4，-6，-8和-9只能感染鸭和鹅等水禽nAPMV-5大多从鹦鹉分离出来，也可以从野 鸟中分离出Introduction nAPMV疾病发生有相当的差异。nAPMV-1（NDV）的临床表现可以从亚临床 表现到严重的表现，从而造成鸡的高死亡 率nAPMV-2可以造成轻微的呼吸疾病和降低产 蛋率，还可以使火鸡不育nAPMV-3与脑炎有关并造成笼养鸡的高死亡 率，还可造成火鸡的呼吸疾病和小鸡发育 不良Introduction nAPMV-4可以造成鸡的肺炎和卡他性气管炎nAPMV-5能使未发育完全的鹦鹉抑郁、呼吸 困难、腹泻、斜颈和严重致命

3、的肠炎，造 成高死亡率nAPMV-6使火鸡出现呼吸疾病并降低产蛋率 ，但对于鸡无致病性nAPMV-7使火鸡出现呼吸疾病和气囊炎，并 降低其产蛋率nAPMV-8和-9不造成任何疾病Introduction nAPMV是一种单股、负链、不分段的RNA病毒， 序列长度范围从14904nt到17262nt，可转录6个 mRNA，进而编码6种蛋白，分别为核衣壳蛋白 (nueleocapsid protein，N)、磷酸化蛋白 (phosphoprotein，P)、基质蛋白(martix protein，M) 、融合蛋白(fusionprotein，F)、血凝素一神经氨酸 酶蛋白(haemagglutin

4、inneuraminidase，HN)和大聚 合酶蛋白(largeprotein，L）nAPMV-6还有一个额外的第七个mMRNA，编码一 个小的疏水蛋白（SH）nP基因还含有2个编码非结构蛋白的基因，分别是 W蛋白和 V蛋白Introduction nAPMV基因顺序为3-N-P-M-F-(SH)-HN-L n病毒转录开始于3端单独的启动子，其复制 是由起始子（GS）和终止子（GE）介导的 开始-终止-再开始的循环过程nAPMVs基因核苷酸长度是6的偶数倍，是为 了有效地RNA复制和多核苷酸在核衣壳的 包装Introduction nAPMV-1的全基因序列及其抗原和序列的多样性已 经被收录

5、n根据F基因的序列，NDV被分为两大类（和 ）。类进一步分为15个基因型，包括已经确定 的基因型（到和 ），还有5种新的基因型 （, ,XIII, XIV 和XV ）n而我们所知的APMV-2到-9的抗原和基因多样性是 非常有限的。APMV-2全基因序列和局部HN序列 的分析显示其有一些亚群，APMV-3全基因序列和 局部M序列的分析显示其有一些亚群存在，APMV -6序列比较显示其存在亚群，APMV-9局部F和HN 基因序列进化分析显示其存在亚群Introductionn野生水禽是NDV和禽流感的容器，同时通过不表 现临床症状来保存病毒。这可以促进对家禽以及 水生和陆生野禽监测项目的发展nA

6、PMV-4经常从各地监测项目中的健康水禽中分离 出来n但是其基因分析从没被报道过nAPMV-4原型（鸭/香港/D3/75）基因全长测序， 还有韩国野鸭和比利时野鸭的APMV-4基因全长测 序，最近还对埃及鹅的APMV-4基因全长测序n比较香港和韩国的基因全长显示其基因多样性是 稳定的，推测其有抗原亚群Introductionn为了进一步了解APMV-4的基因多样性，对 P,M,F和HN基因测序，用5组意大利鸭分离 出的APMV-4进行试验，并与公布的香港、 韩国和比利时的APMV-4序列进行比较n同时研究抗原多样性所到达的程度Materials and methodsn病毒和细胞nAPMV-4

7、分别为意大利鸭3670/06（IT-3670） 意大利 野鸭3936-70/06（IT-3936） 意大利短颈野鸭4103- 27/06（IT-4103） 意大利野鸭4284-20/06（IT-4284） 意大利野鸭4523-4/（IT-4523） 香港鸭D3/75（ HK）（国际兽医实验局）n用9日龄SPF鸡胚培养，免疫4天后收集感染的尿囊液，并 测定各自的效价n美国标准菌库提供鸡胚成纤维细胞细胞系，在含10%牛胎 血清的细胞培养基中培养。用效价为28血凝单位的100倍稀 释病毒液感染该细胞（含或不含1ug/ml胰蛋白酶的无血清 细胞培养基），连续7天观察细胞病变效应以及细胞培养 液上清的血

8、凝活性Materials and methodsnP,M,F和HN基因测序n不连续蔗糖梯度离心分离病毒n试剂盒提取RNA（QIAGEN, USA ）ncDNA合成：RNA提取液， 逆转录试剂盒（Invitrogen ） ，随机引物或APMV-4引物（5-CTAGGGTGGGGAAGG- 3）nPCR扩增：1.F和HN扩增 引物 p4247 (5-CACTGATCACTGGAAATGTAA-3) p4365 (5-TCACACCTCCCCGCCACGAAA-3) p5490 反转录 (5-CCCCACTGAGACACTTGACTAACT-3) p5340 (5-TCAATAGGGATGGTGGA

9、CTTTA-3) p6239 (5-GTGCATGGTAGGGTGGGGAAGGTA-3) p6390 反转录 (5-ACTTCTGTTGACTTCTCTTGGTA-3) p6291 (5-ACCAAGAGAAGTCAACAGAAGTAT-3) p8223 反转录 (5-ACGTGGGTGCGAGTCAAGGAACAA-3) Materials and methodsn2.P和M扩增 引物 p1331 (5-GACGACTTCCCACTGTCGGGATCCATGCCGGCTCTCTC-3) p2005 反转录 (5-TTGGGCCTCTTGAGTCTGGCTTTGGCTGC-3) p1875

10、(5-GATCATCAGGCCAACGAC-3) p3160 反转 录 (5-ACAGCAGTTCTTTTTGGTGGGTTGG-3) p3043 (5- GGGCTCCCTCATCTTCAGACACG-3) p4357 反转录 (5- CTTTTGTTTAGACACCCAATCAACT-3)n3.Taq酶（Invitrogen）n琼脂糖凝胶电泳n直接测序或复制到拓扑异构酶载体（BDT测序试 剂盒）Materials and methodsn序列对比和进化分析 the SeqMan and EditSeq programs of the Lasergene 8 (DNASTAR) clusta

11、lW multiple alignment algorithms of MagAlign program of DNASTAR the basic length alignment search tool (BLAST) the Kimura-2 parameter in the MEGA version 4.0 program n数据库收录号n意大利分离的APMV-4免疫鸡 共7组，每组3只2周龄 SPF鸡，香港组，意大利5组，对照组，免疫当天和21天收集血清n血清学分析 HI试验（同源） 交叉HI试验（异源） 进行统 计分析Results n意大利株体外生长特点 n意大利株在9日龄鸡胚和鸡

12、胚成纤维细胞DF-1细胞系上培 养的复制特点与以前得到的香港株、韩国株和比利时株相 似n在鸡胚高效复制，免疫后4天尿囊液的效价高达29 HA单位 ，而在DF-1细胞几乎不感染，产生的最大效价是24 HA单 位n在培养中外源蛋白酶并不影响病毒复制Results n局部基因序列的测定n香港株、韩国株和比利时株的全基因序列已经测定n本实验中，测定了意大利株局部基因序列N基因末端到L基因始端， 测定这个范围的基本原理：M,F和HN是内部相关蛋白，而P是多变的 内部蛋白n全长6598nt，占全基因的44%，与所有APMV-4株相同n香港株始端信号是13nt（3-UCCCACCCCUUCC-5），其中有3

13、和1nt分 别与基因的N和F不同（UCCACACCCUUCC 和 UCCCACCCCUUCA） ，其他株型的P,M,F和HN基因序列均相同n香港株末端信号是12nt（3-AAAUUAAUUUUU-5），其中有2,1和1nt 分别在P,M和L基因不同（AAAAUAAGUUUU, AGAUUAAUUUUU, AAAUUAUUUUUU）nM基因末端信号不同：意大利株和比利时株UUAGUUAAUCGUUU， 香港株UAGUUAAGUUUUUU，韩国株UUCGUCAAUCGUUUResults nP基因n意大利株长度为1364nt，编码33aa的P蛋白，这与香港株和 韩国株和比利时株相同，有10个丝氨酸

14、，6个苏氨酸和一 个络氨酸残基是潜在的磷酸化位点n意大利株之间P基因核苷酸与转录的氨基酸一致性达97.2- 100%和97.5-100%，与韩国株一致性达97.5-98.2%和96.6- 98%，与比利时株一致性达96.6-98.8%和96.2-98.7%，与香 港株一致性达89.2-90%和92.1-93.1%nP基因442-450nt位置有相同编辑位点5-AAAGGGGGG-3， 在这里有一个非模板的甘氨酸残基，可以产生V蛋白（其 氨基酸序列与韩国株和比利时株一致性比与香港株的高）Results nM基因n意大利株长度1293nt，编码370aa的M蛋白（意大利株、韩 国株和比利时株），香港株编码369aa的M蛋白（3端未翻 译区）n其核苷酸和氨基酸序列一致性同样很高nF基因n1891nt，566aa，其序列特点是蛋白裂解位点(DIPQRF)、 糖基化位点、半胱氨酸和七肽重复区，然而N端