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1、第2 4 卷增刊分析测试学报V 0 12 A! 些兰! 望! ! 些! ! 型! ! ! 坠! 塑竺型兰坠竺! 竺! ! ! 塑型塾兰些大鼠血浆中6 种甘草黄酮成分的浓度检测方法李利，梁世瓢，李川( 中国科学院上海药物研究所上海2 0 1 2 0 3 )小柴胡汤出自后汉张仲景的伤寒论，由柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣等7 味中药组成，为中医和解少阳的经典方剂。现代临床试验证明该方对治疗慢性肝炎有效”J 。为研究小柴胡汤的药效物质基础，我们围绕其中的活性成分开展体内药代动力学研究。在本项工作中主要涉及来自甘草的甘草素二糖苷( I i q u i r i t i na p i o s i
2、 d e ，L Q A ) 、甘草苷( | i q u i r i t i n ，L Q N ) 、甘草素( 1 i q u r i t i g e -n i n ，L Q G ) 、异甘草素二糖苷( i s o l i q u i r i t i na p i o s i d e ，I L A ) 、异甘草苷( i s o l i q u i r i t i n ，I L N ) 、异甘草素( i s o l i q u r i t i g e n i n ，I L G ) 6 个活性成分”“J ，以液质联用( L C M S M S ) 技术为手段，首次建立了一个灵敏、稳定、可靠的8m i
3、 n 内同时分析6 种化合物的方法，并用于S D 大鼠体内的药代动力学研究，为揭露机体对这些化合物的暴露水平，了解小柴胡汤中药复方的药效物质基础提供了分析方法。1实验部分1 1 仪器与材料S u r v e y o r 高效液相色谱仪和F i n n i g a nT S QQ u a n t u m 三重四极杆质谱检测器。色谱纯级乙腈、甲酸铵购自美国S i g m a A l d r i c h 公司，重蒸水由本实验室制备。L Q A 、L Q N 、L Q G 、I L A 、1 L N 、I L G 纯品( 纯度大于9 8 ) 由甘草提取物经H P L C 分离纯化得到。内标化合物( I
4、 S ) 银杏内酯C ( G i n k g o l i d eC ，G C ) 购自中国药品生物制品检定所。小柴胡汤按伤寒论的组成用水煎煮制成。1 2L C M S M S 分析条件K r o m a s i lC t s 色谱柱( 5 0m mx 2 1n l n l ，5 L m ，中国科学院大连化学物理研究所) ；流动相：乙腈一水体系，梯度洗脱。质谱采用E S I 离子源，负离子检测，在S R M 模式下监测的离子反应分别为：L Q G 及I L G ，m z2 5 5 一1 1 9 ；L Q N 及I L N ，m z4 1 7 q 5 5 ；L Q A 及I L A ，m z5 4
5、 9 - - - , - 2 5 5 ；G C ，n d z4 3 9 - - - * 3 8 3 。1 3 动物实验与样品处理一只s D 大鼠灌胃( 相当于5g 生药材k g ) 小柴胡汤水提物，在给药前和给药后0 0 8 、0 2 5 、O 5 、t 、1 5 、2 、4 、6 、8 、1 1 、2 4h 分别采血，于4 ，27 9 8r r a i n 下离心1 0 m i n ，5 0I L L 血清用于分析。乙酸乙酯提取样品。2 结果与讨论2 1 方法学验证2 1 1 特异性该方法特异性好，内源性物质对分析无干扰。2 1 2 标准曲线的建立用空白血浆配置质量浓度0 3 2 0 、1
6、6 0 、8 0 0 、4 0 0 、2 0 0 、10 0 0n s m L的混合物标准溶液进行处理。以待测物浓度( x ) 为横坐标，待测物与内标峰面积之比( y ) 为纵坐标， 通过加权最小二乘法( 权重系数为l x ) 回归，所得回归方程为标准曲线。L Q A 、L Q N 、L Q G 、 I L A 、I L N 和I L G 的标准曲线方程分别为：Y = 0 0 2 89 x 一0 0 0 0 1 ，Y = 0 1 2 95 X 一0 0 0 72 ，Y =0 1 4 25 X + 0 0 1 03 Y = 0 0 4 39 X + 0 0 1 40 ，l ，= 0 0 9 29
7、 X 十0 0 0 9 ，Y = 0 0 9 78 X 一0 0 1 11 。6 个化合物在0 3 2 10 0 0n g m L 线性良好( r 0 9 9 8 ) ，定量下限为0 3 2n g m L 。2 1 3 回收率6 个化台物及内标的提取回收率在5 3 5 一8 8 5 ，R S D 为3 4 9 6 1 3 1 9 6 。 2 1 4 准确度和精密度考查低( 1 6 0n g m L ) 、中( 4 0 0n g m L ) 、高( 10 0 0 - 影n l L ) 3 个Q C浓度。结果表明，准确度在8 5 一1 0 7 ( 日内) ，9 8 一1 1 0 ( 日间) ；精密
8、度为0 8 9 6 8 5 ( 1 3内) ，0 8 一8 8 9 6 ( 1 3 间) 。基盒资目：9 7 3 项目( 2 0 0 5 G B 5 2 3 4 0 3 ) ；国家自然科学基金项目( 3 0 2 7 1 5 9 6 ) ；上海市科委项目( 0 1 D J I 9 0 0 8 ；0 4 D Z l 9 2 1 5 )1 5 6 第5 期分析测试学报增刊2 1 5 稳定性在3 个冻溶循环、提取溶剂以及重溶溶剂中都是稳定的。同时，在本实验条件下，查尔酮( I I A ，I L N ，I L G ) 与二氢黄酮( L Q A ，L Q N ，L Q G ) 之间无转化， 无基质效应干扰
9、，化合物闻检测没有C r o s st a l k 。因此，建立的方法灵敏、稳定、可靠。并且8m i n内同时分析6 个目标化台物，适合于大量生物样品的高通量分析。图1 所示的是同时分析6 个甘草 黄酮类化台物3 对同分异构体的L C M S M S 色谱图。害1 n 0。5 ：# 1 0 0 5 00耋1 ：0毛1 ：、 0图J6 种化台物段内标的色谱心i & 二L 墓k 兰 讼兰襄3 讼兰图2 大鼠灌胃给药小柴胡汤后血中6 种甘草黄酮成分的药时曲线囝2 2 药代研究中的应用图2 是一只大鼠灌胃给药后的血药浓度一时间曲线图。结果表明，苷能以原形吸收，苷元L Q G 与I L G 在B e a
10、 g l e 犬体内灌胃后的吸收有明显的多峰，可以延长机体对它们的暴露时间。由此可见，本文建立的方法适合于开展服用小柴胡汤后甘草黄酮类活性成分在大鼠体内的药代动力学研究。参考文献： 1 】H I R A Y A M AC ，O K U M U R AM ，T A N I K A M AK ，e ta l J G a s t r o e n t e r o lJ p n 1 9 8 9 ，2 4 ：7 1 5 2 J U N Z OK ，A K I Y O S H lS ，T A K A Y U K I A ，e t 耐 J E u rJP h a r m a c o l ，2 0 0 5 ，5
11、 0 7 ：1 6 3 1 6 8 3 S H I N J I R OK ，T A K A Y U K IM ，I K U K OK ，e ta 1 J B i o lP h a n nB u l l ，1 9 9 5 ，1 8 ：1 3 8 2 1 3 8 6 4 P A Nx ，K O N GK D ，Z H A N GY e t d J A e t a P h a r m a c o lS i n ，2 0 0 0 ，2 1 ：9 4 9 9 5 3 D e t e r m i n a t i o no fS i xA e t i v eL i c o r i c eF 1 a v o
12、n o i d si nP l a s m ai nP a r a l l e lb yL C M S M SUL i L I A N GS h i - p i a o L IC h u a n( S h a n g h a iI n s t i t u t eo fM a t e r i aM e d i c a ，C h i n e s eA c a d e m yf o rS c i e n c e s ，S h a n g h a i2 0 1 2 0 3 ，C h i n a )A b s t r a c t ：F 1 0 v a n o i d sf r o ml i c o r
13、i c ea r e ag r o u po fa c t i v ec o n s t i t u e n t sp r e s e n ti nC h i n e s em u h i h e r br e m e d yX i a o c h a i h u t a n g T ou n d e r s t a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ei n g e s t i o no fX i a o c h a i h u t a n ga n dt h el i v e rd y s f u n c t i o n ，ag
14、 o o di n v e s t i g a t i o no ft h eb i o a v a i l a b i l i t ya n dp h a m m c o k i n e t i c so fa c t i v ec o n s t i t u e n t sp r e s e n ti sn e e d e d I nt h i ss t u d ) , ，w ed e v e l o p e dt h ef i r s tm e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fs i xl i
15、c o r i c ef l a v o n o i d s ( 1 i q u i r i t i na p i o s i d e ，l i q u i r i t i n ，l i q u i r i t i g e n i n ，i s o l i q u i r i t i na p i a s i d e ，i s o l i q u i r i t i n ，i s e l i q u i r i t i g e n i n ) i np l a s m ao fr a t sm -c e i v i n gas i n g l eo r a ld o s eo fX i a o
16、 c b e i h u - t a n ge x t r a c t T h en e wm e t h o di n v o l v e du s i n gl i q 血dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yi ns e l e c t e dr e a c t i o nm o n i t o r i n gm o d e la n dh i s hl e v e l so fs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yw e r ea c h i e v e d 1 1 l em e t h o dw a 8v a
