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1、植物抗病基因的结构特点、抗 性表达遗传机理和进化2011201066 张志远抗病基因（R）概念l从广义上讲植物抗病基因(resistance gene)与防 御反应基因(defense gene)都是在植物抗病反应 过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。所谓 抗病基因所指的与病原菌无毒基因相对应的，存 在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或 其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特 有的一类基因。植物防御反应基因的特点是，在 抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基 因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成 型或诱导型表达的一类基因。 抗病基因的抗病机理一、基因对基因假说Flor (
2、1971)根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究 提出了基因对基因假说。其基本内容是：病原体 与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型，亲和与 不亲和病原体分别含毒性基因(VIR)和无毒基因 (AVR)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和 抗病基因(R)。当携AVR 基因的病原体与携R 基 因的寄主互作时，二者表现不亲和，即寄主表现 抗病性；其他3 种组合则表现为亲和，即寄主感 病。抗病基因的抗病机理二、激发子/受体模型(elicitor-receptor model)激发子/ 受体模型是从基因对基因假说发展而来的 。该模型认为：病原体的AVR基因直接或间接地 编码一种配体(激发子)，它与R基因编码的
3、产物( 受体)相互作用，从而触发受侵染部位细胞内的信 号传递过程，激活其他防卫基因的表达，产生超 敏反应。例如，拟南芥抗病基因Rps2编码的受体 蛋白与病原体无毒基因AVRRps2编码的蛋白(激 发子)相互识别，产生传递信号，引起活性氧中间 体的大量聚集，激活其他防卫基因的表达，导致 超敏反应，在病原体侵染部位出现枯死斑点症状 ，使植物获得抗性。抗病基因的抗病机理三、防卫假说( guard hypothesis )防卫假说认为：在病原体侵染植物并营造适合其生 长的有利环境时，病原体把植物体内的一种蛋白 卫兵(guardee)作为靶子并加以改变，这种改变是 植物受到病原体侵害的信号。植物抗病基因
4、蛋白 (guard)能检测到这种信号植物卫兵蛋白的改变 ，其途径可能是通过检测植物卫兵蛋白与病原体毒 蛋白形成的复合体。当植物抗病基因蛋白发现其卫 兵受到攻击时，抗病性被触发。这个过程可能并不 需要抗病基因蛋白和无毒基因蛋白间发生直接的作 用。防卫假说中植物抗病基因蛋白不仅能识别无毒 基因蛋白，而且能监视被病原体毒性/ 致病蛋白作 为攻击目标的重要植物蛋白/ 复合体。抗病基因的抗病机理四、信号的产生和传递虽然三个假说的机理不同，但都认为植物 的抗病的关键在于植物细胞首先感知胞外 信号以及通过膜传入胞内的信号，细胞内 信号分子集聚，进一步引起蛋白的磷酸化/ 去磷酸化反应，信号被传递并且放大，最
5、终增强抗性基因的翻译表达。所以植物抗 病，抗病基因发挥着不可替代的作用。抗性基因的结构近年来，由于分子生物学的发展，有很多抗病基 因已经被克隆出来，通过序列及氨基酸比对这些 抗病基因发现，尽管抗病（R）基因之间的序列 同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有 一些相似的结构特征.根据这些结构特征，已经克 隆的R基因可以分为5个大类：STK，LRR-TM， NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hml。众多的抗病基 因中，有很大一部分的抗病基因都具有核苷酸结 合位点（NBS）、富含亮氨酸重复( LRR) 和亮氨 酸拉链（LZ）基序。先对这几个基序的结构作个 介绍。核苷酸结合位点（NBS）NBS
6、 存在于真核生物的许多蛋白中, 如AT Pase、延伸因子( elong ation factor s) 、异 质三聚体、GTP结合蛋白( G proteins) 、R 基因编码蛋白等, 这些蛋白对于细胞的生长 、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防 御反应都有关键性的作用。尤其是R基因编 码产物中NBS的存在，表明R基因的功能之 一是磷酸化，通过磷酸化识别配体，导致 一系列抗性反应的发生。NBS主要氨基酸 的突变可导致抗性的降低或消失。核苷酸结合位点（NBS）lNBS 由三个区域组成, 第一区域为磷酸结合环( P- loo p) , 又称激酶( kinase) la, 作用是结合ATP 或 G
7、TP 的磷酸, 第二区域为激酶2, 共有特点是4 个 疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的带负电荷的天 冬氨酸, 但在植物中, 这一区域的两边还具有高保 守的氨基酸。值得一提的是, 含有TIR 的R 基因产 物激酶2 最后一个氨基酸残基为天冬氨酸, 而其他 为色氨酸。第三区域为激酶3a, 与DNA 的嘌呤或 核糖结合有关, 通常含有一个精氨酸残基。(a) RPS4和RPS5中NBS结构域的结构,显示保守基序的位 置.蛋白质结构是带状图所示: P-loop (蓝色); RNBS-A (绿); kinase-2 (品红); RNBS-B (green); RNBS-C (绿); GLPL ( 黄); R
8、NBS-D (绿); MHDV (橘黄).富含亮氨酸重复( LRR)富含亮氨酸重复( LRR) 因亮氨酸在这一结构中呈 规律性重复而得名。LRR 存在于多种功能不同的 蛋白中, 与蛋白质之间的相互作用及信号传导有密 切关系。在酵母、果蝇、哺乳动物、人体以及植 物中均发现含有LRR 结构的蛋白存在。如酵母的 腺苷酸环化酶、果蝇的Toll 蛋白、人血清中的2- 糖蛋白、猪的核糖核酸酶抑制蛋白等都含有LRR 结构。在植物中, 含LRR 的蛋白在细胞生长发育 、抗病反应过程中起着重要作用, 主要有类受体蛋 白激酶、R 基因编码蛋白和多聚半乳糖醛酸酶抑 制蛋白。lR 基因编码蛋白所含的LRR 结构可大至
9、分为两大 类: 一类是定位于胞外的LRR, 如Cf -2, Cf -4,Cf - 5, Cf -9, X a21; 另一类是初步定位于细胞质的 LRR, 主要见于含有NBS的R 基因产物中。除甜菜 的Hs1Pro-1的LRR 比较接近于胞质LRR 外, 胞质 LRR 与胞外LRR 在重复数和结构上都有明显的区 别。从重复数上看, 胞外LRR 的重复数一般较高, 最高可达38 个重复, 如Cf -2 基因。重复单位一般 为24 个氨基酸残基, 并且绝大多数重复的结构相 当完整。而胞内LRR 重复数一般仅有14 个左右, 个别也有21 和28 的。有趣的是, 这些重复数均为 7 的倍数, 重复单位
10、所含的氨基酸残基数虽然也大 约为24, 但为不完整重复。从结构上看, 胞外LRR 第14 位上的残基为甘氨酸, 这是其位于胞外的重 要特征, 另外第17 位上的残基为脯氨酸。富含亮氨酸重复( LRR)从猪核糖核酸酶抑制蛋白晶体立体结构中发现, 每 个LRR 的该部分构成了一个短的-折叠片, 而其 下游的氨基酸残基构成了-螺旋, 所有重复的-折 叠片平行于共同的轴心, 形成一个非球状的马蹄形 结构。在这一结构中, 保守的亮氨酸残基形成疏水 的核心, 而其它非保守的氨基酸残基暴露于马蹄形 外周而形成了配体结合表面。R 基因LRR 的结构 与之相似, 这使我们在一定程度上能够从分子上解 释“基因对基
11、因”的相互作用: 即保守的亮氨酸形成 疏水的与无毒基因编码蛋白配体结合的结构, 而非 保守区决定了与配体结合的特异性。富含亮氨酸重复( LRR)l根据拟南芥抗病原菌 假单胞菌丁香蛋白5（ RPS5）中的LRR预测 的LRR域结构 (a)一个 代表性的RPS5 LRR 域的结构预测。-折 叠形成凹脸的“马蹄形” 由箭头所示。保守脂 肪残留由蓝色表示。 N,氨基末端; C,羧基末 端. (b) 在12个核心蛋 白聚糖中富含亮氨酸 重复的比对结果和在 RPS5中13重复以及氨 基端的9个氨基酸。保 守脂肪残留，以蓝色 显示。富含亮氨酸重复( LRR)亮氨酸拉链（LZ）lLZ 存在于一些寡聚蛋白中,
12、许多DNA 结合 蛋白就含有LZ。LZ 中每7 个氨基酸残基构 成一个重复,第7 位置上的残基为( 异) 亮氨 酸。这些( 异) 亮氨酸在蛋白质二级结构中 形成-螺旋的疏水脊, 在疏水交互作用下, 两个LZ 中的( 异) 亮氨酸残基形似拉链, 将 其所在的亚基聚合成多聚体。由于LZ 的独 特的拉链结构, 从而有利于蛋白质的二聚化 、三聚化, 并促进蛋白质之间的特异相互作 用。根据结构特征对R基因的分类1)丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶域（STK）R基因如番茄Pto基因，其产物是一个没有 LRR结构域，位于细胞质内的典型的丝氨 酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，该激酶在 抗病反应信号传导
13、中通过磷酸化其它信号 分子而传导信息。目前已经有证据表明Pto 蛋白能与相应无毒基因avrPto的产物相互作 用。 2）LRR-TM(富亮氨酸重复跨膜受体蛋白)LRR-TM类基因是植物应答病原菌侵染重 要的受体类抗病基因，该类基因相对保守 且以基因簇的形式存在，通常编码一类跨 膜受体蛋白(Receptor like proteins, RLPs) ，编码蛋白由6个保守的结构域组成。l结构域A是N端信号肽，结构域B由N端成熟蛋白 和一个亮氨酸拉链LZ基序组成。结构域C由数量 不等的LRR重复单元组成，具有 LxxLxxLxxLxLxx(N/C/T)x(x)LxGxIPxx。保守序列 中，保守的G
14、ly是胞外LRR的重要标志。该结构域 参与蛋白质的相互作用和配体识别，不同基因N 端胞外结构域LRR重复单元的数量与不同病原菌 生理小种激发子的识别特异性有关，它能够直接 或间接识别病原菌的激发子而激活寄主的抗病信 号传导及防卫反应此外结构域C通常含有许多潜在的糖基化位点 (Asn-X-Ser,N-X-S或Asn-X-Thr,N-X-T)，表明 RLPs可能是锚定于细胞膜上的糖蛋白受体。跨膜 结构域E是由疏水性氨基酸构成的螺旋，两侧的 结构域则是由带负电的胞外结构域D和带正电的 胞内结构域F组成，这两个结构域对蛋白质在细胞 膜上的定位和锚定起着重要的作用。结构域F可能 参与胞内信号分子的识别与
15、信号传导，部分RLPs 的胞内结构域F还含有一个YXX(为带有疏水性 侧链的氨基酸)胞吞信号，它能够激发受体介导的 胞吞作用和随后对受体复合物的降解作用。l3)NBS-LRR类R基因的共同特点：在它们 编码蛋白的近N端处存在着核苷酸结合位点 (nucleotide binding site，NBS)。而在它们 的近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列 (leucine-richrepeat，LRR)。LRR是蛋白与 蛋白相互作用的一种典型结构，它是由十 多个折叠-环-螺旋基本单位串联形成的空 间构型，呈蹄铁(horseshoe)状的结构。 l这些膜受体的LRR结构伸展于细胞外，蹄 铁状结构的凹陷处
16、便是结合多样性配体的 部位。该类R基因又可分成3个亚类，即LZ NBSLRR亚类，如RPS2、PRS5、 RPP8、RPP13、RPM1、Rx2、Prf、Mi基 因；TIR-NBS-LRR亚类，如RPS4、RPP5 、N、L6、L11、M基因：NBS-LRR亚类， 如l2、Xa1、Pib、Bs2、Cre3基因。 lNBS-LRR 类, 位于胞内。多数R 蛋白都可 归为这类。许多NBS 域具有ATP 或GTP 结 合活性, 能水解ATP, 并可通过磷酸化和去 磷酸化调节蛋白的识别功能, 而且它具有一 些非常保守的氨基酸序列,被广泛用于R 基 因家族的分类研究, 所以可认为NBS 域对应 的DNA 序列区应同样具有保守性, 可用已有 R 基因的保守序列设计引物进行抗病基因 类似物( RGA) 的克隆。l植物NBS - LRR类蛋白法通过信信号网络途 径，并诱发了一系列植物防卫反应，如过 氧化酶的激活，丝裂原相关蛋白激酶级联 反应，诱导活化病程相关基因，在拟南芥 中，至少有三个单独的信号传导途径由 NBS-LRR类蛋白激活。l4)LRR-TM-
