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1、1液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用 Liquid Chromatography -Mass Spectrometry朱 娜朱 娜 CONTAINLiquid Chromatography Structure Progress ApplicationMass Spectrometry Quadrupole Iron trap Time-of-flight Applicationhistory1906年俄国植物学家Tsweet创立色谱法30年代茨维特分离绿叶色素40年代TLC，纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代末HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩 大HPLC Analy
2、sis ParametersPumpDegasserAutosamplerColumn CompartmentSolvent ReservoirsDetectorMobile PhasesFlow Rate CompositionInjection Volume Column Oven TemperatureWavelength Time ConstantAuto SamplerSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsMixerPumpsSeparation in based upon differential migration between th
3、e stationary and mobile phases.Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, SilicaHigh Performance Liquid ChromatographWasteMobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column.2Optimal Flow Rates for LC ColumnsCommon HPLC Detecto
4、rsUV-VIS 65%RI ELSD10%Electro 10%FLD 8%MSUV-VIS 可变单波长检测器VWD 二极管阵列检测器DAD MS：质谱检测器RI: refractive index detector示差折光检测器FLD: fluorescence detector荧光检测器ELSD：evaporative light-scattering detector 蒸发光散射检测器电化学检测器紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温
5、度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。DADUV detectorRI通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比；灵敏度低、对压力和温度敏感、不能用于梯度洗脱；流动相流速影响检测信号（流通池的几何形状、大小及材 料、检测器的光路系统）3RI可分为：偏转式、反射式和干涉型三种；ELSD是90年代开始在全国普及，作为新一代通用检测器的逐 步替代示差检测器。 优点： 通用型质量检测器 灵敏度高于RI 可以进行梯度洗脱 可作为SEC和SFC色谱/细内径LC检测器 可测定磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂 限制： 受样品组
6、分和流动相的挥发性的影响，不能完全替代示 差检测器FLD高灵敏度、高选择性；线性范围宽，外界条件及 流动相的影响小应用范围窄背景荧光、淬灭荧光等干 扰 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；电化学检测器测量溶液整体性质（通用性强）电导检测器和电容检测器 离子色谱法最主要检测器 测定多种阴阳离子的灵敏检测器 检测信号是离子电导与流动相电导之差、负值. 温度对信号的影响比较大 抑制柱降低本底电导.可分为抑制电导和非抑制电导二 种类型测量溶质组分性质（灵敏度和选择性好）安培、极谱、库仑、电位检测器检测器的发展检测器的发展保留时间保留时间示差折光紫
7、外示差折光紫外增强结构确认能力增强结构确认能力FTIR质谱质谱PDA保留时间保留时间增加选择性增加灵敏度增加选择性增加灵敏度荧光 电化学The ChromatogramInjectiontotR mAUtimetRto -elution time of unretained peak tR-retention time - determines sample identityArea is proportional to the quantity of analyte.4Parameterresolution ：RTheoretical plate : nseparation selectiv
8、ity ：acapacity factor ：Kresolution RRttWWttWWrrrr=+=+2121 1 221212()()SigtimeSigtimeSigtimeresolution Rresolution RRNkk=+22241 1()() 初始增大k增大Nt改变S色谱参数色谱参数容量因子：K=(TR-T0)/T0溶质在色谱柱中分离后的容量因子K,1K10 可以通过改变溶剂的洗脱强度来改变K洗脱强度加大，降低洗脱物的容量因子0.980.970.910.890.830.750.500.33k/(1+k)5030108.05.03.01.00.5k色谱参数色谱参数分离选择性
9、：a aKB/KA 对分离度影响较大 改变流动相组成 改变流动相PH值 改变柱温 改变容量因子0.500.330.0910.010.0010( -1)/ 2.01.51.11.011.0011.0 5影响分离的因素在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。1. 影响分离的因素流速流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量
10、仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。2. 固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。3. 流动相及流动相的极性（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
11、，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、
12、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏
13、 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。（）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。（）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。6Mass Spectrometry质谱分析法（MS）是将分析样品离子化，使带 正电的离子加速并在电磁场的作用下，按不同的 质荷比(m/z)分开，
14、形成相应的质谱图。根据质谱 峰出现的位置，可进行定性分析，根据质谱峰的 强度可进行定量分析Mass Spectrometry70年代末出现最早的质谱检测器，80年代后期电喷雾技 术的发展LC-MS技术开始成熟。1992年， ESI（大气压电喷雾）1993年， APCI技术的出现（大气压化学电离）为小及中 等分子量有机物，药物及代谢物分析提供了帮助。目前质谱检测器应用越来越多。 LC-MS：结合HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与 MS的独特选择性、灵敏度、分子量及结构信息与一体困难在于LC-MS压力匹配问题、流量匹配问题、难挥发 溶剂的排除问题Mass Spectrometry “Simpl
15、ified”离子源离子源现将主要介绍电喷雾源电喷雾源(Electron spray Ionization，ESI)1、电子电离源、电子电离源(Electron Ionization ，EI) 2、化学电离源、化学电离源(Chemical Ionization , CI )。 3、快原子轰击源（、快原子轰击源（Fast Atomic bombardment, FAB） 4电喷雾源电喷雾源(Electron spray Ionization，ESI) 5大气压化学电离源大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI)离子源的作用是将欲
16、分析样品电离，得到带有 样品信息的离子。质谱仪的离子源种类很多:ESI7Mass SpectrometryQuadrupoleIron trapTime-of-flightFourier transform ion cyclotron resonanceQuadrupoleIron trap8Time-of-flightQuadrupole是目前最成熟的 用于HPLC的质谱 分析器 质谱图可靠 所需的真空度相 对较低Four ages of ion trap technologyLtq Mass9“3D” vs “2D” or Linear Ion TrapLinear Ion Trap Stability飞行时间质谱计工作原理简单。质量分析器既不需要磁场，又不需要场，只需要直线漂移空间，因此，仪器的机械结构较简单，增长漂移路程工作原理简单。质量分析器既不需要磁场，又不需要
