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1、第 6 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 2 2015 年 2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb. , 2015 基金项目: 北京市科委重大专项(食品中植物生长调节剂与物种成分风险多指标同步筛查鉴别和定量技术研究) Fund: Supported by Key Program for Beijing Municipal Science 量化研究; 实时荧光定量 PCR; 鸡肉; 牛肉 Real-time PCR method for quantitative detection of chicken b
2、lending in beef HU Zhi-Kai, SONG Li-Ping*, JIANG Jie, XUE Chen-Yu, GUO Miao, WANG Dan, ZHAO Lin-Na (Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China) ABSTRACT: Objective To quantitatively analyze the beef and chicken in blending samples. Methods The prim
3、ers were designed according to the sequence of the single copy gene. A series of genome DNA were used as standard curve in real-time PCR. The mathematical conversion parameters about the mass of meat and DNA were determined. The weight/weight equivalents of beef and chicken in four blending samples
4、were analyzed using real-time PCR. Results The weight/weight equivalents of beef and chicken was determined by calculated using Ct, standard curve and the mathematical conversion parameters about the mass of meat and DNA. The results showed that the absolute error of detection with a tolerance of le
5、ss than 5%. Conclusion Quantitative analyzing of the composition of the animal species in single component sample could be realized using real-time PCR by designing the primer according to the sequence of genome. This research could provide technical support for food safety. KEY WORDS: meat adultera
6、tion; quantitative analysis; real-time PCR; chicken; beef 第 2 期 胡智恺, 等: 实时定量 PCR 法对牛肉中鸡源性成份的量化检测 551 1 引 言 目前在市场上不同肉类的价格相差很大, 因此有些商贩会故意掺假来牟取利益, 这种行为不但损害了消费者的利益, 而且也干扰了正常市场竞争秩序的建立。通常检测机构会应用荧光实时定量 PCR检测技术, 通过使用针对不同物种线粒体基因设计获得的特异性引物, 对食品中的动物源性成份进行鉴定1-4。线粒体基因进化速度快, 物种的区分度高, 在科研上宜为物种分类的靶基因5-9。但是, 在食品物种鉴定
7、工作中, 该种检测技术则表现出其特有的局限性。 这种局限性主要表现为不同物种细胞中线粒体的拷贝数各不相同, 因此, 以线粒体为靶基因的检测结果很难定量分析出食品中的动物源性成份的组成比例, 这对于监管执法是相当不利的1, 10-13。因此, 急需研发出一种可以有效判定肉类食品是否掺杂使假的技术手段。 与线粒体基因相比, 一些持家基因属于单拷贝基因, 有利于进行量化分析14,15。Rene 等16开始探索定量分析食品中的动物源性成份的技术方法, 他们的研究报告指出, 使用根据基因组中单拷贝基因设计的引物进行荧光实时定量 PCR 实验可以实现在基因水平上对动物源性成份的定量分析。宋丽萍等17根据猪
8、的单拷贝基因 -actin 和绵羊的单拷贝基因催乳素受体所设计的特异性引物对猪、羊混合的纯瘦肉样本中的动物源性成份进行定量分析, 获得满意结果。 本文为了初步探讨定量分析食品中牛和鸡源性成份组成的可能性, 采用牛瘦肉和鸡瘦肉作为研究样本, 以基因组中单拷贝基因为靶基因设计引物和探针, 通过绘制标准曲线和确定基因质量比系数, 实现对生鲜牛肉中掺有鸡肉的比例进行定量检测。 为肉类掺假量化研究的进一步发展提供方法借鉴。 2 材料与方法 2.1 材料与仪器 实验中所用牛肉和鸡肉均为精瘦肉, 购于北京市石景山区的物美超市(西黄村店)。混合肉样制备的比例(牛肉: 鸡肉)为 20%: 80%, 40%: 6
9、0%, 60%: 40%和 80%: 20%。 荧光 PCR 试剂(premix Ex Taq TM)购于 TaKaRa公司。其他常用试剂均是国产试剂。 3K18 离心机购自美国 Sigma 公司; MyiQ 单色实时定量 PCR 仪购自美国伯乐公司; 核酸测定仪(Eppendorf Biophotometer Plus)购自 Eppendorf 公司。 2.2 实验方法 2.2.1 DNA 提取 将样品用液氮研磨至粉状。加入 CTAB, 65 水浴 30 min, 5000 r/min, 4 , 离心 5 min, 取上清液; 加入等体积的酚/氯仿混合物, 剧烈震荡, 12000 r/min
10、, 4 , 离心 15 min, 取上清液; 加入等体积的氯仿, 剧烈震荡, 12000 r/min, 4 , 离心 10 min, 取上清液; 加入等体积的异丙醇, -20 放置 10 min, 12000 r/min, 4 , 离心 10 min, 弃上清液; 加入 75%的乙醇, 7500 r/min, 4 , 离心 5 min, 弃上清液, 晾干沉淀。 用 200 L 的无核酸水溶解沉淀。并测定 DNA 的浓度。 2.2.2 标准曲线的绘制 分别取 50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、300 ng 和 350 ng 的牛源性 DNA 和鸡源性 DNA 为
11、模版进行实时荧光 PCR 扩增。以 lg DNA 为横坐标, Ct值为纵坐标作图, 分别绘制牛源性 DNA 和鸡源性DNA 的扩增标准曲线。 2.2.3 实时荧光 PCR 扩增 2.2.3.1 引物和探针 所有的引物和探针在赛百盛生物公司合成, 探针的荧光标记为 5-FAM 和3-TAMRA。 具体的引物和探针序列见表 1 (表 1 中核酸序列的方向为 5-3)。 表 1 实验所用的引物和探针列表 Table 1 The sequence of primers and probe 引物/探针名称 工作浓度(pmol) 序列 扩增长度（bp）Beef F 10 GTAGGTGCACAGTACGT
12、TCTGAAG 96 Beef R 10 GGCCAGACTGGGCACATG Beef Probe 10 CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGCA Chicken F 10 CCAACATGCCTTTAAACCCTCA 76 Chicken R 10 GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG Chicken Probe 10 TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTC 注: 表中所有核酸序列均为 5-3方向。 552 食品安全质量检测学报 第 6 卷 2.2.3.2 实时荧光 PCR 反应体系 反应体系为 20 L, 其中模版 DNA 2 L(阴性对照用水代替 DNA
13、模板), 2Premix Ex Taq 10 L, 上、下游引物各 0.5 L(10 pmol/L), 探针 1 L(10 pmol/L)。 2.2.3.3 实时荧光 PCR 扩增条件 95 30 s; 95 , 5 s; 60 , 30 s。进行 40 个循环。 2.2.3.4 数据计算方法 在本实验中 M=dDNA(公式 1), 其中 d 为常数, 是不同肉类样品质量与该样品所提出的 DNA 质量数的比值(即 d=M/DNA)。 3 结果与分析 3.1 引物及探针的特异性检测 所有引物均需进行特异性检测以确保进行荧光实时 PCR 检测反应的准确性。分别以羊、牛、猪、 鸡、 鸭、 狗、 猫、
14、 鼠的 DNA 作为扩增模板, 用1.2.3 的方法进行荧光实时 PCR 反应。实验结果如表 2 所示, 表 1 中所设计的引物均具有很好的特异性。 3.2 牛肉和鸡肉 DNA 扩增标准曲线的绘制 为了使用荧光实时 PCR 技术检测混合样品中不同动物源性成分的百分比含量, 有必要绘制牛源性和鸡源性 DNA 的扩增标准曲线。按照 1.2.3 的方法进行荧光实时PCR扩增反应, 如图1所示, 牛源性和鸡源性 DNA 的荧光 PCR 扩增的 Ct 值与 lg DNA 含量之间呈线性关系, 其函数关系式分别为: 牛源性Y=-4.19X+35.39; 鸡源性 Y=-3.566X+34.17。 其中 Y
15、为Ct 值, X 为 Lg DNA 值。 3.3 相同质量的牛肉和鸡肉所提出的 DNA 浓 度差异 为使用荧光实时 PCR 技术检测样品中不同动物源性成分的质量百分比, 有必要检测相同质量牛肉 和鸡肉提取的 DNA 浓度差异。分别取 0.1 g 和0.05 g 牛肉和鸡肉, 按照 1.3.1 的方法提取 DNA, 实验结果如表 3 所示。 当质量为 0.1 g 时, d 牛=M牛/DNA 牛=1120, d 鸡=M 鸡/DNA 鸡=170; 当质量为 0.05 g 时, d 牛=M 牛/DNA 牛=1190 , d 鸡=M鸡/DNA 鸡=226。 其中不同质量时, d 的差异可能是由于操作误差
16、或者仪器检测误差造成。 在本研究中 d 取两次实验的平均值, 即 d 牛=1155, d 鸡=198。 图 1 牛源性 DNA 和鸡源性 DNA 的扩增标准曲线 Fig. 1 The DNA amplification standard curve 注: A 为牛源性扩增标准曲线, B 为鸡源性扩增标准曲线。 表 2 引物与探针的 DNA 扩增特异性验证 Table 2 The DNA amplification results for testing the primers and probe 项目 羊 牛 猪 鸡 鸭 狗 猫 鼠 牛引物及探针(Ct) N/A 27.01 N/A N/A N/A N/A N/A N/A 鸡引物及探针(Ct) N/A N/A N/A 27.63 N/A N/A N/A N/A 注: 表中 DNA 浓度为三次实验的平均值。N/A 为 40 个循环的扩增未检测到荧光值 第 2 期 胡智恺, 等: 实时
