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1、生物化学和分子生物学实验 1 必须穿白大褂； 2 书包放在实验台的上层架子上； 3 实验报告在实验课后24小时内由组长统一上交； 值日生注意事项强调： 1 清洁实验台上层架子； 2 用湿抹布擦黑板； 3 清洁比色皿； 4 将所有移液枪调到最大量程。第一节 分光光度法 (Spectrophotometry) 定义： 根据物质对光的吸收特性和吸收 强度，对物质进行定性和定量的分析方 法。溶液的颜色实质是它所吸收的色光的互补 色。如：日光照射KMnO4，其中绿光被吸收 ，故溶液呈紫色。CuSO4呈蓝色是由于溶液吸 收了黄光。溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光 的
2、吸收程度。溶液的颜色http:/zh.wikipedia.org/wiki/%E9%A2%9C%E8%89%B2互补色互补色光如：黄光和蓝光；红光和绿光。光光是一种电磁波。自然光是由波长（） 不同的电磁波组成的混合光。可见光可见光， 在400760nm范围。光的吸收定律To a specific wavelength, LA=KLC A=KLC C：物质的浓度， g/L molL L：光程，cm， K：吸光系数 摩尔消光系数：当溶液浓度为lmolL，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 百分比吸光系数K：当溶液浓度为l00gL，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 吸光系数只与物质
3、的性质和入射光的波长有关。波长的选择 波长的选择一般是选择待测物质最大吸 收峰的波长(max) 1应使被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.10.7，而以0.20.6最理想。2应使干扰影响降低至最低限度。3应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。待测溶液浓度的计算 1.利用标准管法计算待测溶液的浓度 2.利用标准曲线进行换算 3.利用LambertBeer定律 计算 A=KLCC=A/KL利用标准管法计算待测溶液的浓度AxAsCx =CsVs Vx1 稀释倍数实验步骤1 2 3 4 5 6 7标 准 管 测定管 空白管试剂蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质
4、测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩脲试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质标准液浓度：Cs=10mg/ml实验记录双缩脲法测定蛋白质浓度 日期 室温A1 2 3 4 5 6 7 标 准 管测定空白0.101 0.202 0.303 0.404 0.505 0.375 0.000公式计算法求蛋白质浓度AxAsCx =CsVs Vx1 稀释倍数0.3750.404Cx =10mg/ml0.8ml 1ml1 10=74.3mg/ml1标准曲线的作用(1) 从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采用
5、方法的呈色反应是否符合LambenBeer氏定律。(2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。(4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。2标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加。(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读23次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。实验步骤1 2 3 4 5 6 7标 准 管 测
6、定管 空白管试剂蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 3.标准曲线图的绘制：用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物
7、质时使用。绘制标准曲线A1 2 3 4 5 6 7 标 准 管测定空白0.101 0.202 0.303 0.404 0.505 0.375 0.000C(mg/ml) 20 40 60 80 100 ? 0C mg/mlA206040801000.10.20.30.40.5.项目、日期、室温仪器型号、编号、波长第二节 蛋白质定量分析 蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用： 1. 临床检测血清蛋白浓度测定； 2. 科学研究纯化蛋白的浓度测定；主要方法 根据蛋白质元素组成凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩 脲法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法， BCA法； 根据蛋白
8、质的吸收特性建立的紫外分光光度 法；http:/ 2 3 4 5 6 7标 准 管 测定管 空白管试剂蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 标准曲线根据Lambert-Beer定律， A与C成正比配制一系列标准液C1、C2、C3，在max下，测相应的A1、A2、A3。C / (mol L- 1)AxCx蛋白质的紫外吸收TyrTrp1. 蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。 它们具有吸收紫外光的性
9、质。 2. 其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内 吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 3. 要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能进行 准确定量。实验步骤样品 测定管 空白管待测血清样本 0.4 生理盐水 3.6 4.0BCA测定蛋白质浓度 在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合 ，并将其还原成一价铜离子Cu1+。 Cu1+和 BCA试剂反应, 形成稳定的紫蓝色复合物。 反应所生成的复合物，在562 nm处有强烈的 光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围 内有良好的线性关系，可用于蛋白质浓度的 测定。管号 试剂试剂 (l)空白管标标准管测测定管12345蛋白质标质标 准液 (1.5mg
10、/ml)20406080100双蒸水10080604020 待测样测样 品100 BCA工作液(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混匀，37保温30min，比色测测定待测样品：将双缩脲待测样本稀释10倍，即取双 缩脲待测样本100ul+生理盐水900ul稀释成 1000ul待测样本。 双缩脲法：540nm，玻璃比色杯，vis-7220 紫外法：260，280nm，石英比色杯，uv-9200或者uv-9600或者uv-2000。调节不同波长时需要再次调零 BCA法562nm，用0.5cm的比色杯，同时应特别注意，BCA法的标准品与双缩脲和紫外法的不同 双缩脲与BCA需做标准曲线。紫
11、外法不需做标准曲线。实验报告 一 原始记录 记录实验所获得的原始数据。标准 测定 空白A0.00原始记录需实验课结束教师签字双缩尿/BCA法测定蛋白质浓度1 2 3 4 5 6 7 A空白A260 A280紫外法测定蛋白质浓度A260/A280=测定实验报告将原始记录置于第一页，装订一同上交。 实验原理（清晰） 实验步骤（简略但清晰） 数据处理（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 实验结果 实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等）双缩脲测定蛋白质浓度计算AxAsCx =CsVs Vx1 稀释倍数0.3750.404Cx =10mg/ml0.8ml 1ml1 10BCA测定蛋白质浓度AxAsCx =CsVs Vx1 稀释倍数0.3750.404Cx =1.5mg/ml80l100 l1 100紫外分光光度法测定蛋白质浓度Cx=A 280KL稀释倍数K= 0.63L /cm.gL=1cm稀释倍数=100实验一实验一 蛋白质定量分析技术蛋白质定量分析技术 双缩脲法双缩脲法 紫外分光光度法紫外分光光度法 BCABCA（二喹啉甲酸）法（二喹啉甲酸）法 LowryLowry法法(Lowry(Lowry改良法改良法) ) 考马斯考马斯( (ComessieComessie) )亮兰结合法亮兰结合法 凯氏定氮法凯氏定氮法一、双缩脲法测定蛋白质含
