《围体外循环期NFκB活性变化的临床研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《围体外循环期NFκB活性变化的临床研究（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、口 体外.环翻N F - K B 活性文化的临床研究鱼彭明扭嚷炎熟蜘举沈应参蜘江互丝毕业 论文 题目 :围 体外 循环期N F - K B , 活 性大 弗的Irk 序 丸生 丛2 匕 丘 专业2 0 0 0 级硕士生 胜名: 丝生毛.指导教师 ( 牲名、职称): 景 华 教 授 主任医师摘要背景: 体外循环诱致的全身炎症反应综合征是心内直视术后并发症和病人术后死亡的原因之一， 它的形成机制和防治是目 前心血管外科领域的研究热点。炎症反应的强弱与编码炎症介质的基因表达有关， 这些基因的表达受转录因子的调节， 在调节这些炎症基因的转录因 子中， 核 因 子k a p p a B 是 许多 促炎
2、介 质 包 括 细 胞 因 子、 粘附 分 子、化学因子、 酶类及急性期反应蛋白 等高表达所必需的转录因子， 且广泛存在于机体各种细胞的胞浆中， 在急 性炎症导致的全身炎症反应综合 征、 多 器官 功能障 碍综合征 及 成人呼 吸 窘迫综合 征等发生 机制中 起着相当 重要的调控作用。因此， 研究围C P B期N F - K B的活性变化及其与细胞因 子活化 表 达之间的 关 系， 深入了 解S I R S 的 分子生 物学发生 机制， 寻 找 新的 治 疗途 径， 对 减 少 术 后 并 发 症的 发 生， 改 善 病人的预后有着重要的临床意义。目的: 通过对围C P B 期患者外周血单个核
3、细胞与心肌细胞N F - K B的活性变化及血浆T N F - a 浓度的动态测定， 观察N F - K B和T N F - a 在围C P B期间的变化规律， 比较N F - u B的活化与血浆T N F - a 浓度的变化是否存在相关性，以初步探讨 C P B术后炎症反应的发生机制，并寻求围C P B期心肌是否存在炎症活动的直接证据。第 1贾 共 6 7页口休外拍环期N P - a B 活性交化的临床研究材料与方法:2 0 0 2 年1 0 - 1 1 月份随机选择2 4 例接受体外循环手术且术中必须切除心脏组织的住院病人作为研究对象， 分为先天性心脏病组( I 组) 与风湿性心脏病组(
4、I I 组) 。 常规建立体外循环， C P B开始前及结束时从右房插管的切开位置获取心肌样本， 部分病人C P B开始后从准备行外科手术的部位获取心室组织:另外，分别在 C P B术中 进行肝素化开始转流之前、 C P B开始后5 m i n . C P B结束时 鱼精蛋白中和之前、 C P B结束后1 小时和C P B结束后6 小时共5 个时间点抽取外周动脉血样， 以上标本均低温储存备检。 提取外周血单个核细胞及心肌组织细胞核蛋白，用 B r a d f o r d法测定提取物中的蛋白 浓度， 采用E L I S A方法检测外周血单个核细胞及心 肌提取物中N F - u B的核易位和血浆
5、T N F - a的浓度。同时记录主动脉阻断时间、 转流时间、心肌组织获取时间及机械通气时间，评定临床疾病严重度评分，分析N F - x B的活性变化与血浆T N F - a 浓度的变化及各影响因素之间的关系及其是否会影响临床结果。 所有数据以 均数士标准差表示， 运用S P S S 1 1 .0 1 统计软件进行配对t 检验分析、 方差分析、回归分 析。P 4 8 0 s ， 常 规建立体外循 环， 使 用复 方林格氏 液加适量全血或血浆/ 白 蛋白 预充， 预充液中加入地塞米松l m g / k g 及 抑肤 酶( 负 荷剂 量5 万u / k g ， 以l m g / k g / h r
6、 持 续 灌 注) ， 中度血液稀释， 保持H C T 在2 02 5 %， 进口 膜式氧合器和德国J O S T R A体外循环机。 C P B期间中心体温降至 2 8 3 2 0C ，灌注流量 7 0- 1 2 0m L .k g .m i n , 灌 注 压 力 维 持 在8 .0 - 1 0 . 7 K P a ( 6 0 - 8 0 m m H g ) 。 术 中 做好心肌保护， 心内 操作完成后左心排气，开放升主动脉，复 温至 3 6 ( 肛温) 循环稳定后停止体外循环辅助， 鱼精蛋白中和肝素。 主动脉阻断时间4 8 . 8 士 2 3 . 5 小时，转流时间8 5 .9 士3 0
7、 .5 小时， 。所有病人均在术后 2 4小时之内拔管，未出现临床肺功能降低表现。所有病人均由同一手术组人员完成手术。5 、研究方法:第 1 4页 共 6 7页围体外材环期N F - K B 活性女化的临床研究5 . 1 标本 采集:5 . 1 . 1 组织取样:C P B开始前及结束时从右房插管的 切开位置获取心肌样本， 部分病人 C P B开始后从准备行外科手术的部位获取心室组织，该部分样品获取前的C P B时间长度随手术修补时间的长度而改变。5 . 1 .2 血样采集:分别在C P B术中 进行肝素化开 始 转流 之前 ( A点， p r e - C P B ) ,C P B开始后5 m
8、 i n C B点，C P B - 5 n i n ) , C P B结束时鱼精蛋白中和之前 ( C 点， e n d - C P B ) , C P B 结 束后1 小 时 ( D点， 1 h p o s t - C P B ) 和C P B结 束后6 小时 ( E 点， 6 h p o s t - C P B ) 共5 个时间点 采集。5 .2标本处理和保存:5 .2 . 1 组织标本:获得心肌样品后，立即放入消毒的不含核糖核酸酶的塑料容器内，并用液氮冰冻储存在一 8 0 以下至检测时。5 .2 .2 全血标本:每次采集5 m l 动脉血置于消毒的肝素化试管中，其中C B P开始和结束时的
9、 血样本取自 左心房， 样本采集后立即以 1 5 0 0 r p m离心l O m i n ， 取血浆样本于一 7 0 0 C下保存准备用于测定T N F - a 。然后将A ,C 两点 剩 余的 全 血 细 胞 置 于 淋巴 细 胞 分 离 液 上， 1 5 0 0 r p m离 心3 0 m i n后， 收集中间层的单个核细胞， 离心弃上清， 并以生理盐水洗涤三次，然后置于一 7 0 0 C下保存以测定N F - u B o5 .3 核蛋白的提取:翻 1 5页 共 6 7页一一 一 进处 丝 芬 担 丝夕适 丝 李 化 的 娜 焦 研 攀5 .3 . 1外周血单个核细胞核蛋白的提取:将收集
10、的单个核细胞以冰磷酸缓冲液 ( P B S ) 洗涤两次，加入0 .2 m 1 预冷的 缓 冲液A l O m M H e p e s ( P H 7 .9 ) , l O M M K C l , 2 m MM g C l 2 , O . 1 m M E D T A , I m M D T T , 0 .5 m M P M S F , 冰浴展荡1 5 m i n ,加 入5 0 u l 1 0 0/ o N P - 4 0 ， 震荡3 0 s , 1 2 0 0 0 r p m 4 离心1 0 m i n 。 在下 层沉淀中 加入5 0 u l 预冷的 缓冲 液B , 5 0 m M H e
11、p e s ( P H 7 . 9 ) , 5 0 m M K C I ,3 0 0 mM N a C l , O . 1 mM E D T A, I mM D T T , 0 . 5 mM P MS F , 1 0 % ( v / v )甘油 ， 冰浴展荡2 0 m i n , 4 0C 1 2 0 0 0 r p m离 心5 m i n , 取上 清， - 7 0 保存以 检测N F - K B a5 .3 .2心肌组织细胞核蛋白的提取:置心肌组织样品于O .a m l 预冷的缓冲液A中， 用研磨器研磨至匀浆 状， 低温( 。 ) 2 0 0 帅m离 心3 0 s ; 弃未 破碎组织; 上
12、 清 冰浴裂解2 0 m i n ， 加入5 0 u l 1 0 % N P - 4 0 , 震荡3 0 s , 4 0C 1 2 0 0 0 r p m离 心l O n - i n .下 层 沉淀中 加入2 0 0 u l 预 冷的 缓冲液B Z 2 0 m M H e p e s ( P H 7 .9 ) , 4 2 0 m MN a C l , 1 . 5 m M Mg C 1 2 , O . 1 m M E D T A , 1 M M D T T , 0 . 5 M M P MS F ,2 5 % ( v / v ) 甘油I ， 冰上孵育3 0 m i n , 0 C 1 4 0 0
13、0 r p m离 心1 5 m i n ， 取 上清，- 7 0 保存以检测N F - K B a5 . 3 . 3核蛋白 浓度的测定:以小牛血清白蛋白 作为标准品， 用B r a d f o r d 法测定提取物中的蛋白浓度。5 .4 N F - K B与T N F - a 浓度的测定:采用E L I S A方法检测单个核细胞及心肌提取物中N F - K B和血浆第 1 6页 共 6 7页一 一一一 ， 一 一一一一一一一一X IW * * SF M N F - ,cs # i 丝 “ G a f feT N F - a的 浓 度。 E L I S A试 剂 盒 分 别 购 于A c t i
14、v e M o t i f l n c .( C a t a l o gN o s .4 0 0 9 6 ) 和G e n e M a y l n c .( C a t a l o g N u m b e r G M K 2 2 3 1 2 ) a5 .5临床疾病严重度评分:按照R o s e n z w e ig o l等的 方 法 评价 术 后心 肌 功 能 不 全的 严 重度。根据以下药物的量化剂量评分:多巴胺( d o p a m i n e ) + 多巴 酚丁胺( d o b u t a m i n e ) +肾上腺素( e p i n e p h r i n e x 1 0 0 )
15、 + 米力农( m i l r in o n e x 1 0 )g g .k g “ .m in 。 评分 f 7以 及 术中 死 亡的 病 人被认 为 有 严重的 临 床 过程。临床结果的评分均在T N F - a , N F - x B的测定之前。统 计分析所有数据以 均数士 标准差( R 士 s ) 表示。 运用S P S S 1 1 .0 1 统计软件， 对两组之间不同时间点N F - K B的活性变化和血浆T N F - a 浓度的变化采用配对t 检验进行分析; 对组内各时间点 数据的 前后比 较采用方差分析 ( A N O V A ) ; N F - K B的 活性变化与血浆T N
16、 F - a 浓度的变化及主动脉阻断时间、 转流时间、 心肌组织获取时间、 机械通气时间 等影响因素 之间的 关系及其是否 影响临 床结果采用线性回归分 析。 P 0 . 0 5 ) ; 但两组患者C P B结束时单个核细胞N F - K B的光密度值较C P B前均有非常显著差异( P0 .0 5 ) ; C P B结束时心房肌N F - K B的活性变化1 ( 0 .2 2 1 0 .0 5 ) . 1 1( 0 .2 3 1 0 .0 5 )两组之间亦无明显差异 ( P 0 .0 5 ) ，但两组较之 C P B前均有非常显著差异 ( P 0 .0 5 ) ;两组C P B开始后血浆T N F - a 浓度即逐渐升高，C P B开始后 5 m i n时第 1 8页 共 6 ，页 勺 型进少巡N F - rc % 些逸丝堕些这( I 组 1 1 9 . 5 3 1 5 9 .4 3 , 1 1 组 1 1 5 .7 6 1 6 5 .5 9 )与C P B之前基础值 ( I 组9
