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1、华中科技大学博士学位论文商陆抗病毒蛋白的原核和真核表达以及体外对HBV的作用姓名：潘延凤申请学位级别：博士专业：内科学（传染病）指导教师：贺永文20050401华中科技人学同济医学院博士研究生毕业论文刖置乙型病毒性肝炎( h e p a t i t i sB ) 是世界常见的传染病，全球乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sBv i r u s ，H B V ) 感染者约3 5 亿人，其中1 3 在我国。H B V 感染者中大约2 5 发展为慢性肝炎，部分发展为肝硬化和肝癌，严重威胁人们的健康。抗病毒治疗是治疗慢性乙型肝炎病毒感染的关键手段U - 3 。目前国内外公认的抗H B V
2、 药物仍然是干扰素一a ( I F N a ) 和核苷类物以及免疫刺激因子，虽然抗H B V治疗取得很大进步，但目前抗H B V 治疗面临着一些问题，如：疗程长；停药后易反跳；容易导致H B V 变异和耐药；对肝功能正常的慢性H B V 感染疗效差【4 ，5 】。所以寻求新的抗H B V 药物是目前国内外研究的热点。商陆抗病毒蛋白( p o k e w e e da n t i v i r a lp r o t e i n ，P A P ) 是一类具酶功能的单链核糖体失活蛋白( r i b o s o m ei n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ，R I
3、 P s ) ，是美洲植物商陆不同组织或不同生长阶段合成的蛋W l o 。由于它们的广谱抗病毒活性和对真核或原核细胞蛋白质合成的抑制，因而受到许多研究者的关注。P A P 是一类天然的广谱抗病毒蛋白，在不抑制宿主细胞蛋白质合成的浓度下就可有效地抑制病毒的复制，能抗多种植物和动物病毒，特别是由于其抗H I V 活性，已引起国内外学者的广泛兴趣和重视1 1 1 - 1 6 。以往的研究认为P A P 的抗病毒活性，是由于它可以使宿主核糖体失活，抑制宿主蛋白的合成，也抑制了病毒的翻译，伴随着一定的细胞毒作用。最近研究发现P A P 的核糖体失活作用和抗病毒活性是分开的，P A P 还存在其他的非细胞
4、毒性的抗病毒作用，包括和病毒核酸( m R N A 、D N A ) 的相互作用。H u d a k 等发现P A P 可以识别并结合帽子结构的m R N A ，对无帽子结构的m R N A无作用。P A P 可以直接识别、并与帽子结构结合，但并不切割帽子结构，而是切割R N A 1 9 , 2 0 。P A P 与m R N A 作用，和P A P 与核糖体r R N A 之间作用机制不同：来自体内的实验也支持以上结论，如P A P 变异体在烟草中表达后，不抑制植物的生长，特异性的抑制病毒的转录【2 l J ；P A P - - N 7 0 是突变第7 0 位的天门冬酰胺酸的P A P突变体
5、，P A P - - N 7 0 失去抑制核糖体失活作用，但却可以识别带有帽子的m R N A ，华中科技大学同济医学院博士研究生毕业论文说明N 7 0 附近的氨基酸是核糖体失活作用所必须的，但对于识别m R N A 帽子结构无作用，由此可见P A P 的这两种生物活性的功能区域不同，作用机制不同I l 。T e l t o w 等发现，P A P 抑制宿主和H S VD N A 的合成，但主要是抑制了H S VD N A 合成，具体机制不详m 】。P A P 还可以松解共价闭合的超螺旋双链D N A ( c c c D N A ) ，并水解特定区域的腺苷酸，使其成为带切口的环状D N A 或
6、线性D N A 。P A P 在c c c D N A 作用过程中，起初c c c D N A ? 艮快变成松弛的D N A 分子，很可能c c c D N A 的一条链有缺口；高浓度的P A P 时，带有缺E l 的D N A 分子转变成线性分子。c c c D N A 的拓朴结构是P A P识别所必须的，在原子显微镜下观察，几种核糖体失活蛋白连接N c c c D N A 的一条链上，却不能识别线性的D N A 双链【2 2 1 。P A P 特异性地识别帽子结构的m R N A 和c c c D N A 从而抑制病毒的翻译等生命活动过程，有助于理解P A P t F 细胞毒性的抗病毒机制
7、。P A P 的突变体是目前研究的热点，具有重要的研究价值。通过基因工程方法，突变P A P 的核糖体失活功能区的部分关键氨基酸，消除或减少核糖体失活作用而保留非细胞毒作用的抗病毒活性，使其成为比较理想的抗病毒药物。基于P A P 抗病毒广谱性，以及文献报道P A P 在D N A ，r B R N A ，以及蛋白翻译水平有抗病毒作用。从理论上推i 贝| J P A P 也可能抑制H B V 复制的各个环节。由于P A P 是一类蛋白，各个蛋白之间的基因差别较大，从商陆植物中很难得到单一的P A P ：对P A P 基础研究包括P A P 的各功能区的位置所在，或对于维持P A P的高级结构及
8、重要生物功能的重要的氨基酸的定位，将是以后研究的重要方面之一；天然的P A P 具有除抗病毒作用外，还具有部分的细胞毒作用，他们的功能区域在不同的位置，因此可以根据临床应用的需要，改造P A P ，达到治疗作用，所以P A P 的变异体比天然的P A P 更具有利用价值。基因工程技术的发展使解决这一难题成为可能。为探讨P A P 在基因治疗方面的应用，本课题设想：将P A P 基因转入人的肝癌细胞系H e p G 2 ，观察H e p G 2 细胞表达P A P ，以及对细胞形态功能的影响。为进一步研究P A P 有无抗H B V 的作用，将P A P - - a 的基因转入H e p G 2
9、 2 1 5 细胞以及用P A P S 体外作用于H e p G 2 2 1 5 细胞，观察其对分泌抗原和H B VD N A 的影响。本课题共分三部分：第一部分P A P a 的基因克隆、原核表达及P A P a 多克隆抗体的制各；第二部分绿色荧光蛋I 刍P A P a 融合表达载体的构建及其在H e p G 2 细胞中2兰型垫查堂旦堕垦堂堕堕主婴塑生望些迨苎的表达：第三部分P A P 体外对H B V 的作用。参考文献 1 】L a iC L ，C h i n eR W , L e u n gN W Y Ao n ey e a rt r i a lo fl a r n i v u d i
10、n ef o rc h r o n i ch e p a t i t i sB N e wE n g l a n dJ o u r n a lo f M e d i c i n e1 9 9 8 ，3 3 9 ：6 1 5 8 【2 】M a r c e l l i nP ，C h a n gT T , L i r aS Ge t a l A d e f o v i rd i p i v o x i lf o rt h et r e a t m e n to fh e p a t i t i sBea n t i g e n - p o s i t i v ec h r o n i ch e
11、p a t i t i sB 2 0 0 3 ，N e wE n g l a n dJ o u r n a lo fM e d i c i n e3 4 8 ：8 0 8 - 8 1 6 【3 】W a n gD K ，C h e u n gA M ，O R o u r k eK E f f e c to fa l p h a - i n t e r f e r o nt r e a t m e n ti np a t i e n t s 、i t hh e p a t i t i sBea n t i g e n - p o s i t i v ec h r o n i ch e p a t
12、 i t i sBAm e t aa n a l y s i s A n n a l so f I n t e r n a lM e d i c i n e l 9 9 3 ，1 1 9 ：3 1 2 - 3 2 3 【4 】K a r a y i a n n i sP _ H e p a t i t i sBv i r u s ：o l d , n e wa n df u t u r ea p p r o a c h e st oa n t i v i r a lt r e a t m e n t J A n t i m i c r o bC h e m o t h e r 2 0 0 3
13、，5 1 ( 4 ) ：7 6 1 7 8 5【5 】F a b i e nZ o u l i mA n t i v i r a lt h e r a p yo fc h r o n i ch e p a t i t i sB ：c a nw ec l e a rt h ev i r u sa n dp r e v e n td r u gr e s i s t a n c e ? A n t i v i r a lC h e m i s t r y & C h e m o t h e r a p y2 0 0 4N o v ；15 ( 6 ) ：2 9 9 。3 0 5 6 】I r v i
14、 nJ D P u r i f i c a t i o na n dp a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ea n t i v i r a lp r o t e i nf r o mP h y t o l a c c aA m e r i c a n aw h i c hi n h i b i t se u k a r y o t i cp r o t e i ns y n t h e s i s A r c hB i o c h e mB i o p h y s 19 7 5 ，1 6 9 ：5 2 2 7 】I r v i n
15、J D ，K e l l yT ，R o b e r t u sJ D P u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so fas e c o n da n t i v i m lp r o t e i nf r o mP h y t o l a c c aA m e r i c a n aw h i c hi n a c t i v a t e se u k a r y o t i cp r o t e i ns y n t h e s i s A r c hB i o c h e mB i o p h y s 1 9 8 0 ，2 0 0 ：4
16、 1 8 8 】B a r b i e r iL ，A r o nG M ，I r v i nJ D ，e t a l P u r i f i c a t i o na n dp a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o no fa n o t h e rf o r mo ft h ea n t i v i r a lp r o t e i nf r o mt h es e e d so fP h y t o l a c c aa m e r i c a n aL ( p o k e w e e d ) B i o c h e mJ 1 9 8 2A p r1 ：2 0 3 ( 1 ) ：5 5 9 【9 1P a r e n t eA ，D eL u c aP ，B o l o g n e s iA ，e t a l P u r i f i c a t i o na n dp a r t i a lc h a r a c t e
