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1、V8 0 2 9 6 乳腺癌前不同病变中多种生物标志物 免疫组化研究硕士研究生正导学级师科申请学位专业培养单位朱月华2 0 0 0 级王德文、黄焰、李晓兵病理学与病理生理学医学硕士病理与病理生理学军事医学科学院附属医院学位授予单位：军事医学科学院论文研究起l 匕时间：二零零二年十月至二零零三年十月E RP Rp S 2O e 吕七r O g e nr e c e p 七O rP r O g e g t e r O n e r e C e p t O r英文缩略词表B r e a s tc a n c e ro e 8 t r o g e ni n d u c e dg e n eH E R 一
2、2 n e uP 5 3H B p 2 7S u p p r e B BQ n c O g e n eH e a 七8 h o c kp r o t e i nC a t h DC a t t 搪p g i n DI H CT r i sA P E SE G FS E 职工I 锄u n o h i 8 t o c h 锄i s t r y雌激素受体孕激素受俸坤袭嘣辑醋耩因原璃基因( c e r b B 一2 )抑，商基因p 5 3应激调节蛋白2 7组织蛋白酶D免疫组织化学T r i 8 ( h y d r o 科m e t h y l ) a I n i n o m e t h a l l e
3、 三羟甲基氨基甲烷3 咖i n o p r o p y l T r i e t l 肼吖8 i l a n e印i d e r I f l i gg r o w 七hf a c 七o r氨丙乙氧硅烷表皮生长茵子s u p e i s e 印i 妇I i 0 1 0 9 y 吕u r 、喝ra 1 1 dr e s u l t 监督、流行病学调查及最终结果方案摘要失活等多种分子事件。雌激素受体职、孕激索受体P R 及雌激素诱导蛋白p s 2 在乳腺癌的发展过程嘲鸯着重要的促进因子的作用。而凰癌基因c e r b B 一2 和抑癌基因P 5 3 在 嘣蛙嘲发展过程中，也起着十分重要的f 仁甩。E
4、述标志物作为预昏胁缈封鼽i 榴嘣鬻苜中已有大量 研究，但本研究以我院外陴砌鼢移娘粥库( 1 9 7 5 _ _ 2 0 0 1 年) 收治的5 0 馒睁嘣弹纯性增生疾腐4 5 例乳腺非艇堕蹭生；4 6 觎唰鼢蚜蝴( 早期阶段癌) 及2 6 例正常乳隙组织为研究对象用免度缎化( s P 法) 检测职、P R 、p s 2 和P 5 3 、c e r b B - 2 蛋白的表达，进行统计分忻，探讨l 、腿、P R 、p s 2 和P 5 3 、c e r 龆2 在2 6 例正常对嬲中阳睦费薄弼另9 为1 1 5 3 、1 5 3 8 、o 、o 暑、o ；在5 0 例乳腺驰屯I ! 描酞隧秭神阳性
5、率分别为2 2 、2 8 、8 9 、6 、4 ；在4 5 例 非典墅黻中阳性率分别为6 4 4 4 、7 3 3 3 、3 1 1 1 e 、1 7 7 8 、1 1 。1 1 ；在4 6 例曝嬲L 腺癌中阳性率分别为6 7 3 9 、5 6 5 2 、3 4 7 8 、2 3 9 1 、和3 6 9 6 。性表达率呈显著连续E 升趋势，瓯、P R 在癌前病变不典型增生组中的表达与在癌组织中的表达接近，显著高于单纯增生组( P 蜀褥存槎戆窳巍蠢霞辩( 4 ) 有完整的I l 蠡麻资料魏熊2 6 铡芷辩翻蹙霹融鬃静障酸鳃酸蜉融零氛瑶，远凑戮躐噎潮织的懒霸醴譬正常缎级之蜡块。 = 免疫缝毂化学恻
6、：( 一) 蟊露翮：A P E s 狡、封阕焉攀澈涛、鼹攀翔骥虢捧( 茹搿淤。) 、琢拳亮馥挠溶( 鬣藏人) 、郾2 单蒯望抗体( 席蝴认) 、P 5 3 鹧克隆抗体( 露蝴 八) 、e r b B - 2 单克隆凌露( 菝撬久)、逶薅瑟s 弘o o 受痰缀姥溢赛 鑫程。鹇谬庭滢瀚鑫毒艺豪孛虫垒黪 技术有黼( 二) 隽法及步骤l 、璇片处理( 1 ) 将载玻片漫人浓硫酸中避夜：( 2 ) 鑫寒辞譬镄，超豢 承，$ o 薅寒漆馥擎手蚤嗣。( 3 ) 锏楚片敢 、以1 ：5 0 比铡湖翱希释的A p E s 中，停留2 0 一3 0 秒，取出，精带再 纯秀翻魏漆滚浏去来绩会懿A P E s ，璧瀵
7、鼹糖孛骧手褥鬻。2 、标本处理( 1 ) 先观察每倒椿本的珏E 染饿切片，挑出筑织包埋好、肿，骜细胞丰富的蜡块。 ( 2 ) 屉魏国掰辫瓣蠡本柞4 # m 触逢蔓卖留琦激张，片l 涂有A p E s 的玻 专学粥嘞片盒串1 0阳性对照：购自迈新生物技7 R 公司。阴性对照：用T B s 替代抗，其余染色同。( 1 ) 烤片，6 0 烤箱过夜； ( 2 ) 二甲黼，5 分钟3 缸( 3 ) 1 0 0 酒精脱二甲苯，5 分钟2 缸；( 4 ) 9 5 酒精脱二甲苯，5 分钟2 缸( 5 ) 8 5 酒糨黜 二甲苯，5 分钟1 缸( 6 ) o 0 5 册B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次；( 7
8、 ) 3 奎蟪晰瞻瓯溶液，1 0 分钟；( 8 ) o 0 5 册B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次；( 9 ) 微波抗原修复，9 2 9 8 榴翘噌 复液中，1 0 分钟，室温下冷却2 0 分钟；( 1 0 ) o 0 5 M T B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次；( 儿) 每张切片撒怔常羊血清，3 7 温箱，2 0 分钟( 1 2 ) 拭去多余血清，每张切片滴加抗，4 过夜；( 1 3 ) o 0 5 肿B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次；( 1 4 ) 每张切片黝畦物素化二抗( 通用型) ，3 7 温箱，3 5 分钟( 1 5 ) o 0 5 册B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次； (
9、 1 6 ) 每张叨崩镕咖黼的缝霉谤翰洼物素蛋白( s P 复合物) ，3 7 温箱，3 5 分钟；( 1 7 ) o 0 5 M T B s 缓冲液冲洗，5 分钟3 次( 1 8 ) 新鲜配制的D A B 溶液显色( 镜下掌握颜色)( 1 9 ) 自来水冲洗，苏木精衬染1 分钟，以盐酸圃隋分化，自来水返蓝；两位医生( 病理科医生和作者) 在不舞B 苣临床结局的情况下甩0 1 y 叫s 显微镜观熬1 0 x物镜下粗选4 个随机视野，每个视野在4 0 】( 物镜下进行细胞计数，计算渫电阳性的细胞占所计数细胞的百分比，取各视野计数舶平均值结台染色强度作为终值。有争议的玻片璃病理科主任在多头显暾镑虾
10、重薪集体判定。职、P R 、P 5 3 阳性染色位于胞核或日包该胞浆同时染色，以核 染呲，仅胞浆染蝴阴性，染色强鼢为3 级：1 浅f 艴；3 深褐色；2 介于1 和3 之间。综合染色强度表达率麴窿$ 示准为：( 一) 完全阴性；( ) 阳性绷翘比铡( 1 0 ；( + ) 阳性细胞比铡1 D _ - 2 5 ；( + + ) 阳性细胞比例2 6 5 0 s ；( + + + ) 阳性细胞比例5 卜1 0 0 二分法以p s 2 胥自的阳性表达位于日色浆，在高倍藏F 曼既瞎隅色细颗幽胞瞒鄱j 粒瞄转包 砖瞰， 染觑豌蝴3 级：1 浅艴；3 黼；2 介于1 和3 之间。综箭凇度表达鹃目l 桃为：(
11、 一) 完全阴性；( ) 阳性纽咆比例l 一1 0 ；( + ) 阳性细胞比例1 卜叼5 ；( + + ) 阻性细 胞比例2 6 5 0 9 ；( + + + ) 阳性细胞比例5 1 1 0 0 。= 分法以1 0 为脚定阴性和阳性。 c _ e r b B 2 显示附僦的唐别茁F 胞膜，商詹貔现“渔网”状，阳性嫡佬枷鲥鞣电或剩期醋嶷同时染色，单独咆犯鼬扔啪白阳陛。染色强度分3 级：1 老翳案色；3 深龅；2介于1 和3 之间。综合染色强度表达率判定舔准为：( 一) 完全阴性；( ) 阳性细孢比鲥1 1 0 ；( + ) 陪陛靴瑭龇制1 1 2 5 ：( + + ) 阳性姐咆比例2 6 5 0
12、 9 ；( + ) 阳性细胞比例5 1 1 0 0 。二分法以1 0 为阈值确定阴性和阳性。( 三) 实验设备1 、s 啪u N 。A s 一3 2 5 婆| 伽片机华骏医疗掰黻有限公司1 22 、L K 一3 组织切片捞烤机航天航空部三十五所3 、防水式电热僮温培养箱( 2 0 一6 0 波动1 ) 湖北黄石市园皆器械厂4 、s i d a 台式培养箱( 3 7 ) 中国重庆制造5 、格兰仕( c a l a n z ) 微波：垆( w D 8 0 0 型) 顺德格兰仕电器有限公司6 、茬窜R 房巴啦l 自瞄撂西啾o 5 1 0 p 1 ( 氲度o 0 1 u 1 ) ，2 2 0 p 1
13、( 膏度o 1 “1 ) ，4 0 2 0 0 p l ( 精度1 p 1 ) ，2 0 0 1 0 0 0 u 1 ( 精度1 0 u 1 ) 。购自 5 乡盟j 4 勉 ：程( j E 京) 有庵酮7 、N a b i l ai n d e s i t 冰箱( 一2 0 一6 0 )8 、o L M P 【J s u B 1 3 0 多头光学显微锗日本制造1 0 、萁邑5 0 0 m l 量筒、l 眦吸管、5 m 1 薄蜡、3 m l j l 多 贽管、染色缸、能屡孵宰验、搽拭纸、盖玻片、可猾计时器等。采用( o ，1 ) 变换。在D ( c e l9 7 中文电子表格中存人数据，转入s
14、A S 软件翘葡努 计分析，全部资料博方t 芷P 2 3 35 8 6 型微机内。分析腿、P R 、p s 2 、c e r b 8 2 、P 5 3 免疫缎化结幂瓶互之可的凳系用x 检验、s p 锄n3 、样本例数小时，采用连续矫正x3 或F i 8 h 精确检验考察两因素的相关性。实验结果羧l ：研勉嶷碎渤临廉懒剿辨龟及E R 、P R 、p s 2 、P 5 3 、c e r b B 一2 身g 表达乳腺单纯性增生5 0憨痰3 0纤维稼瘤1 0腺瘸伴纤维腺瘤8罢管痣乳头狡饔瘸2不典型增生症4 5l 级2 7I I 级1 4I 珏级 原发陡黼4 6原饿癌5i 瓣隧癀6I I 期乳腺癌3 5
15、3 8 6 4垂O S3 6 ，83 2 7 53 93 9 6 73 7 。6 74 2 1 44 4 。5垂5 。6 15 0 2垂S 。8 34 4 荩32 8846 4 4 47 3 3 33 1 1 11 7 7 81 1 1 16 7 3 95 6 5 23 4 7 82 3 ，9 13 6 9 6辫耪蟀淡裘l ：溺鼢秭露辫睐枣1 9 7 s 一2 0 0 l 每镧潜l 镬蘸斓绶鹣事，雾漆翔瓣谚蠹翳季露共1 0 4 8 例，9 糙出术魍砦曾生症4 5 例，占! 曾f 、鞘臁息幽獭构4 2 9 不趔蟛雕E 蚵盼锻参照P a g e 殿阚秀婚惫羚鞠赫辑i 薹 缀。不热鹫彗缬融 穗缓I
16、级，娃一殛甄麟毅蠖磐瞵涵熬7 8 8 侧，。骈选4 6 铡斌器灌瀑艨癌蚴为糊阶段癌( 1 9 9 7 年u I c c 分期标准) 。1 48 07 06 0 孳5 0 措 锺4 0 摧 越3 0 匿 2 0l OO巍腺癌翦不弱癜交多种生辏轹悫钫表达正常单纯不典型乳腺瘢说明：l 、正常：戚常对照组：单纯：单纯性增生缀；不典型：不蹙型增生组：乳腺燎：癌组。 2 、E R 、P R 、p S 2 、 e r B _ 2 襁各组中阳性表逃举s p e a a n 秩相关分析呈线性柏荚( 秩相关系数分别为：o 4 4 6 3 7 t 0 3 6 2 5 0 ，o 2 9 7 6 8 ，旺3 6 4 6 8 ；P 均 & 0 5 Xl 堪i
