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1、原核生物的转录 及其调控 RNA transcription and regulation in prokaryotes 转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链的过程。 不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。 转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。第一节 转录概述一、基因的编码链和有意义链 模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负（）链，又称无义链。 编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，或正（）链，又称有义链。二、转录的基本
2、要点 底物：NTP； 模板：反义链； 方向：53 ； 酶：RNA pol ； 产物：RNA单链转录和复制：都是遗传信息的传递三、转录起始位点 转录起点位点核苷酸为1。 上游序列upstream ：转录起点的前面的序列， 用负数码（）表示，起点前一个核苷酸为1。 下游序列downstream： 转录起点的后面的序列 ，用正数码（）表示。 没有编号为的碱基。第二节 原核生物转录的相关酶类 一、E.coli RNA聚合酶 E.coli只有一种聚合酶； E.coli RNA pol全酶由5种亚基组成，即2，480kD； 2 构成核心酶，核心酶与因子构成全酶。 E.coli RNA聚合酶的基本性质RNA
3、 polymerase in prok. Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor initiation 依靠静电作用力依靠空间结构非专一性与非特异DNA 结合专一性与 特异DNA结合半衰期；60半衰期；数小时cover 60bp Richard Burgess and Andrew Travers (1969) 150 kD160 kD70 kD40 kDCartoon illustrating separation of the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS-PAGE1、核心酶：催化磷酸二酯键的形
4、成 亚基：2个，功能多样（核心酶的组建因子、促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促进RNA pol与DNA 模板链上游转录因子结合） 亚基：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的形成； 亚基：碱性强，与模板链结合；二、RNA聚合酶各亚基的功能2、因子： Reusable； 修饰 RNA pol 的构型； 识别启动子，但无催化活性。不同原核生物具有基本相同的核心酶，但亚基有所差别，决定了原核生物基因的选择性表达。3、原核生物RNA聚合酶抑制剂： 利福平（Rifampin）：与细菌RNA pol 亚基结合，阻碍转录的起始作用； 利链菌素（ streptolydigin）：与细菌RNA pol 亚
5、基结合，抑制转录的延伸。 肝素：与细菌RNA pol 亚基结合，阻碍其与模板DNA的结合。第三节 原核生物转录的过程 RNA的转录包括promotion，elongation，termination 三过程； 从promoter到terminator称为transcriptional unit； 原核生物中的转录单位多为 polycistron ； 转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream一、转录的起始 关键：全酶能以很高的亲和性结合在启动子promoter ； 启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一
6、段DNA序列。promoter 由两个重要部分组成 （一）原核启动子的结构 -70 -40 ：up element（上游元件）CAP-cAMP binding site -35 -10：core promoter（核心启动子）RNA pol. binding site 基因表达调控的正控制位点CAP ： Catabolite gene Activator ProteincAMP Acceptor Protein（cAMP受体蛋白）（分解代谢基因激活蛋白 ）1、核心启动子： Sextama Box： （R site）TTGAC（Sextama Box）-35 site。RNA pol. loos
7、ely binding sitePribnow Box： TATAAT（pribnow Box ）-10 site。RNA pol. firmly binding site（B site ）Initiation site ：+1 site。 RNA transcriptional startpoint （I site） A/G-35 (R)-10 (B)+1 (I) RNAl Sextama Box与Pribnow Box间距17bp，有利于RNA pol启动l -35 Box or -10 Box mut. 间距趋近于17 bp，up mutation间距远离于17 bp，down muta
8、tion17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要-35 Box and -10 Box mut. 转录效率下降100倍 转录效率下降1000倍2、上游元件： CAP-cAMP binding site （Activator region，AR）当：ARI + CAP-cAMP AR I ：CAP-cAMP 的强结合位点（-70 -50） AR II： CAP-cAMP 的弱结合位点（-50 -40）cooperative effect提高ARII 的结合效率IR-70ARI-40ARII IR -50RNA polAR II + CAP-cAMP 复合体：促使-35 box附近GC岛区的双
9、螺旋结构稳定性降低，-10 box的解链温度降低，有利于转录启动 ARI ARII GC Island -35 -10 Null AR II RNA pol. into -10 Box but transcription off ARII + CAP-cAMPpromotionRNA pol. into -35 Boxinto -10 Boxstarting transcriptionRNA pol RNA pol-CTDCAP-cAMPARI ARIIARI ARIIActivation transcriptionUp element + CAP-cAMP RNA Polymerase复合体
10、CAP-cAMP 与RNA Polymerase的-CTD结合，激活转录 （二）原核基因转录的起始 1、因子的作用： 降低全酶与一般DNA的非专一性结合力（20000倍）； 增强全酶与启动子R site、B site的专一性结合力 （100倍）； 导致RNA链的延伸缓慢Promoter与 factor 间的结合专效性决定了 strong promoter & weak promoter； -35 box, -10 box的差异影响启动子与RNA pol 中因子的结合能力；不同启动子的-35，-10 box间存在较为保守的标准序列（标准启动子）； factor is responsible fo
11、r recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.2、RNA pol与启动子的结合 因子识别启动子上结合位点。 RNA pol全酶与-35 box结合封闭型启动复合物； 酶向-10 box移动，并与之牢固结合，促使-10 box及起始位点处发生局部解链开放型启动复合物； DNA解螺旋扩展到-10 box下游17bp范围。3、转录起始位点的决定 酶与-10 box 的结合，决定了第一个起始碱基的选择。 第一个被转录的碱基离-10 box 的保守T约69nts。 mRNA的起始位点多为G
12、，其次为A ，很少为U, 起始点核苷酸的两侧分别为C 和T。4、三元复合物的形成和因子的解离 RNA合成一开始，就形成模板-RNA pol-RNA的三元复合物。 因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的水平，RNA pol在DNA链上变得容易移动，为链的延伸创造了条件； 游离的因子可以重新进行功能循环。 转录的起始 核心酶在因子帮助下特异性结合到DNA上； RNA pol与启动子-35 box 结合，形成封闭型起始复合物； 酶滑动到-10 box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初 的2个核苷酸； 酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在R
13、NA链合成了89个碱基后，因子解离，转录开始。 Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt二、原核生物转录的延伸 RNA pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构； 转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA； RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。 17bp螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度影响RNA延伸速度的因素： RNA p
14、ol； 暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。 GC富集区：产物RNA不易释放； IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。 其他配基：ppNpp、NusA蛋白。NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA + core E antiterm
15、ination N protein utilization substanceNusA binds to polymerase, and N binds to both NusA and box B of the nut site region of the transcript, creating a loop in the growing RNA. This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site (These conditions exist only in vitro.). (Nut N binding site )antitermination N protein三、原核生物转录的终止 转录的终止依赖于RNA产物的特定序列； 原核和某些真核生物的终止子要求转录产物RNA 3端具有发夹的二级结构，茎部富有GC序列； 终止子的分类： 根据终止反应是否需要蛋白1、不依赖于因子的终止子（强终止子） 结构特点：RNA具有一个发夹结构（
