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1、实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度N 端C 端相关知识相关知识l l目前常用的有五种经典方法：目前常用的有五种经典方法： 定氮法：灵敏度0.21.0mg 双缩脲法（Biuret法）：120mg Folin酚试剂法(Lowry法)：50100g 紫外吸收法：5g 考马斯亮蓝法（Bradford法）：15g 方方 法法灵敏度灵敏度时时时时 间间间间原原 理理干干扰扰扰扰物物质质质质说说说说 明明凯凯氏定氮法 ( (KjedahlKjedahl法法) )灵敏度低灵敏度低, , 适用于适用于0.2 0.2 1.0mg1.0mg氮氮, ,误误 差为差为 2 2费时费时 8
2、81010 小时小时将蛋白氮转化为将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后氨，用酸吸收后 滴定滴定非蛋白氮非蛋白氮( (可可 用用TCATCA沉淀沉淀 蛋白质而分蛋白质而分 离离) )用于标准蛋白质用于标准蛋白质 含量的准确测定含量的准确测定; ; 干扰少干扰少; ;费时太长费时太长双双缩脲缩脲缩脲缩脲 法法 ( (BiuretBiuret法法) )灵敏度低灵敏度低1 1 20mg20mg中速中速 20302030 分钟分钟多肽键碱性多肽键碱性 Cu2Cu2紫色络紫色络 合物合物硫酸铵硫酸铵; ;TrisTris 缓冲液；某缓冲液；某 些氨基酸些氨基酸用于快速测定用于快速测定, , 但但 不太灵敏不太灵
3、敏; ; 不同蛋不同蛋 白质显色相似白质显色相似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏5050 100100 g g快速快速 5 51010 分钟分钟各种蛋白质中的各种蛋白质中的 TyrTyr和和TrpTrp残基残基 在在280 nm280 nm处的光处的光 吸收吸收嘌吟和嘧啶嘌吟和嘧啶 ；各种核苷；各种核苷 酸酸用于层析柱流出用于层析柱流出 液的检测；核酸液的检测；核酸 的吸收可校正的吸收可校正FolinFolin酚酚 试试试试 剂剂剂剂 法法 (Lowry(Lowry法法) )灵敏度高灵敏度高 5 5 g g慢速慢速 4040 6060分分 钟钟双缩脲反应双缩脲反应; ; 磷磷 钼酸磷钨酸试
4、钼酸磷钨酸试 剂被剂被TyrTyr和和PhePhe还还 原原硫酸铵硫酸铵; ; TrisTris 缓冲液缓冲液; ;甘氨甘氨 酸酸; ;各种硫醇各种硫醇耗费时间长；操耗费时间长；操 作要严格计时；作要严格计时； 颜色深浅随不同颜色深浅随不同 蛋白质变化蛋白质变化考考马马马马斯亮斯亮蓝蓝蓝蓝 法法 (Bradford(Bradford法法) )灵敏度最高灵敏度最高 1 15 5 g g快速快速5 5 1515 分钟分钟考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时与蛋白质结合时 , ,其其 maxmax由由465 465 nm nm 变为变为595nm595nm强碱性缓冲强碱性缓冲 液；液；Tri
5、ton Triton X-100;SDSX-100;SDS最好的方法最好的方法; ; 干扰干扰 物质少物质少; ; 颜色稳定颜色稳定; ; 颜色深浅随不同颜色深浅随不同 蛋白质变化蛋白质变化一、实验目的一、实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理 和方法。和方法。进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原 理和使用方法。理和使用方法。 加热 NH322H180双缩脲双缩脲2222二、实验原理二、实验原理双缩脲反应:碱性环境碱性环境 H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-
6、RH2O紫色络合物含有两个或两含有两个或两 个以上肽键的个以上肽键的 化合物均有双化合物均有双 缩脲反应缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲 反应。在碱性溶液中蛋白质与反应。在碱性溶液中蛋白质与CuCu2+2+形成紫红色形成紫红色 络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比 ，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因 此被广泛地应用。此被广泛地应用。 在一定的实验条件下在一定的实验条件下, , 未知样品的溶液与标未知样品的溶液与标 准蛋白质溶液同时反应准蛋白质溶液同时反
7、应, , 并于并于540540560560nmnm下比下比 色色, , 可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样 品的蛋白质浓度。品的蛋白质浓度。 除除CONHCONH有此反应外，有此反应外，CONHCONH2 2， CHCH2 2NHNH2 2，CSCSNHNH2 2等亦有此反应。等亦有此反应。三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器（一）仪器吸量管吸量管(1ml/2ml/5ml)(1ml/2ml/5ml)、试管及试管架、分光光度计。、试管及试管架、分光光度计。（二）材料（二）材料标准蛋白溶液标准蛋白溶液( (10mg/ml BSA)10m
8、g/ml BSA)、 未知液未知液( (人血清人血清 1010) )（三）试剂（三）试剂双缩脲试剂双缩脲试剂 溶解溶解0.175 0.175 g g硫酸铜（硫酸铜（CuSOCuSO4 4 5H5H2 2OO）溶于溶于 1515mlml蒸馏水，置于蒸馏水，置于100100mlml容量瓶中，加入容量瓶中，加入3030mlml冰冷的蒸馏冰冷的蒸馏 水和水和2020mlml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1212h h，再加再加 蒸馏水对刻度，摇匀备用。蒸馏水对刻度，摇匀备用。 四、实验操作步骤四、实验操作步骤（一）（一） 标准曲线的制作标准曲线的制作试试试试 管管剂剂
9、剂剂 号号 0 01 12 23 34 45 5标标标标准蛋白溶液准蛋白溶液 (ml)(ml)0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0蒸蒸馏馏馏馏水水(ml)(ml)1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 0蛋白蛋白质浓质浓质浓质浓 度度 (mg/ml)(mg/ml)0 02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.0双双缩脲试剂缩脲试剂缩脲试剂缩脲试剂 (ml)(ml)4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0充分混匀后充分混匀后, , 室温下室温下(2025(2025) )放置放置30min3
10、0minA A540540（二）（二） 绘制标准曲线绘制标准曲线以每管蛋白的含量为横坐标以每管蛋白的含量为横坐标, ,其相对应的其相对应的A A520520为为 纵坐标纵坐标绘制标准曲线绘制标准曲线。（三）未知样品蛋白质浓度的测定（三）未知样品蛋白质浓度的测定 取取2 2只试管，每只分别加入只试管，每只分别加入1 1mlml稀释的未知样品，稀释的未知样品， 再分别加入再分别加入4ml4ml双缩脲试剂，操作方法同前。双缩脲试剂，操作方法同前。然后，测然后，测540nm540nm处光密度值，取其平均值。从绘处光密度值，取其平均值。从绘 制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。 五、实验结果五、实验结果Y Y N N 血清样品蛋白质含量血清样品蛋白质含量 = = 100100V V其中：其中： Y Y为标准曲线查得蛋白质浓度为标准曲线查得蛋白质浓度(mg/ml)(mg/ml)N N为稀释倍数为稀释倍数V V为血清样品所取的体积为血清样品所取的体积(ml)(ml)
