《银杏内酯b对内皮祖细胞氧化损伤的保护作用及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《银杏内酯b对内皮祖细胞氧化损伤的保护作用及机制研究（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、答辩委员会成员：论文答辩日期：目录缩略词对照袁1中文摘要2英文摘要4前言6材料与方法8结果1 5分析讨论2 2，J 、结2 5参考文献”2 6附录2 9致谢O IOO60OOOO BOOOO 一3 0综述及参考文献3 1学位论文独创性明4 3温州医学院硕士学位论文缩略词表( A b b r e v i a t i o nt a b l e )温州医学院硕士学位论文银杏内酯B 对内皮祖细胞氧化损伤的保护作用及机制研究中文摘要目的：观察银杏内酯B 对氧化低密度脂蛋白( O x - L D L ) 诱导的人外周血内皮祖细胞( E P C s ) 氧化损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：R 采用
2、密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞( 心C ) ，以5 1 0 个c m密度接种细胞到事先包被纤维连接蛋白的2 4 孔培养板中，每孔加入M 1 9 9 培养液l m i 包含有1 0 胎牛血清、青霉素( 1 0 0 U m 1 ) 、链霉素( 1 0 0 U m 1 ) 及V E G F( 1 0 n g m 1 ) 、b F G F ( 1 0 n g m 1 ) ) 。培养3 天后，用培养液洗去未贴壁细胞，得到的贴壁细胞继续原条件培养。培养至第6 天，收集贴壁细胞用不含胎牛血清的M 1 9 9 培养液培养2 4h 后，采用流式细胞术分析培养细胞C D 3 4 、V E - C a d
3、h e r i n 、V E G F R 一2 、A C l 3 3 的表达及因子相关抗原免疫组化来证实培养细胞的内皮属性，观察培养细胞的形态特征以鉴定E P C s 。将培养2 4 h 后的细胞随机分成4 组：正常对照组，氧化低密度脂蛋白损伤组( 含0 0 5 m g m lO x - L D L ) 、银杏内酯B0 0 5 m g m l 保护组、银杏内酯B0 I m g m l 保护组。干预2 4h 后，采用C C K 8试剂盒测定观察E P C s 的活力；并取各组细胞裂解液用S O D 、M D A 试剂盒进行超氧化物歧化酶( S o D ) 活力、丙二醛( 肋A ) 含量检测。结果
4、：培养3 7 天后的人外周血单个核细胞呈典型的内皮细胞样集落。培养6d 后流式细胞仪分析示C D 3 4 、V E - C a d h e r i n 、V E G F R - 2 及A C l 3 3 阳性细胞比例分别为6 5 0 9 1 1 8 9 、4 4 6 9 9 7 4 、3 0 4 6 9 2 3 与1 9 6 8 0 8 1 。C D 3 4 、V E - C a d h e r i n 双阳性细胞比例为4 1 6 7 i 0 1 8 ，V E G F R - 2 、V E - C a d h e r i n 双阳性细胞比例为2 8 1 9 1 4 8 5 ，C D 3 4 、
5、A C l 3 3 双阳性细胞比例为1 8 6 7 1 2 7 ，V E G F R 一2 、A C l 3 3 双阳性细胞比例为1 5 1 0 7 4 2 。培养两周后，因子相关抗原免疫组化阳性，胞质呈棕色，空白对照及阴性对照不显棕色。人外周血内皮祖细胞与O x - L D L 共同孵育2 4 h 后，细胞C C K 8 试剂盒o D 值明显低于正常组( P 1pM ) 时反而缩短，利用膜片钳发现，在0 1 - 3l aM 浓度范围内提高内向钙离子和外向钾离子电流( 钾离子外流造成膜电位的复极) ，降低K 1 离子电流( K 1 为钾离子的内向整流) 。由于心脏病尤其是心律失常涉及多种离子通
6、道的开启和关闭，不同剂量的G K B 可能通过不同的通道改善心律失常，这需要制定它对心脏作用的量效曲线，便于对其作用机制的更深入的研究。6 对呼吸系统的作用P A F 是一种能诱导慢性气道炎症和支气管高反应状态的炎症介质。银杏内酯B 通过抑制外周血嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的减少，从而发挥预防和治疗支气管哮喘作用。此外，银杏内酯B 还可以抑制卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯( P M A )联合钙离子载体( C I ) 对哮喘患者的人外周血单核淋巴细胞激活，以及显著逆3 5温州医学院硕士学位论文转激活相关的C D 4 5 R A 的表达，同时伴随皿A D R 表达减少的趋势。银杏内酯B联合环孢霉素A 治疗哮
7、喘，其作为哮喘治疗的新疗法初期的评估认为有效】。银杏内酯B 联合抗氧化类胡萝卜素虾青素抑制T 细胞激活的效果较单用两种药要更佳。这两者的联合也较其他联合用药更佳，如常用的抗组胺药：盐酸西替利嗪和氮卓斯汀的联用。由此可以认为银杏内酯B 联合虾青素是药物治疗哮喘的一种新平喘配方1 。7 对消化系统的作用7 1 降低肝硬化门脉高压作用G K B 通过拮抗P A F 受体作用降低肝硬化门脉压力。已知肝脏是P A F 合成和作用的主要场所，P A F 是强有力的肝脏血管收缩剂和全身血管扩张剂。Y a n g 等m 3 运用四氯化碳诱导大鼠肝硬化模型时发现，肝脏P A F 含量升高，由细胞流出的P A F
8、 量增多，动脉血中P A F 升高( P 分别是P O O l ，P O 0 1 ，P O 0 5 ) 。测定肝脏P A F 受体m R N A 、蛋白水平和啊一P A F ，确定肝脏分离的窦周细胞上P A F 受体密度升高。门脉注射G K B ( 5 m g k g ) 对肝硬化后升高的门脉压力的缓解率为2 3，但对P A F 所致全身系统低压无反应。T X B ：具有强烈的收缩血管作用，有实验证明G K B 能完全阻断T X B 。( 一种血栓烷) 的合成，推测降低肝硬化门脉高压作用与此有关。7 2 治疗急性胰腺炎急性胰腺炎( A c u t ep a n c r e a t i t i
9、s ，A P ) 是胰酶自身消化引起的化学性炎症，后期存在多器官的功能紊乱，病死率非常高。P A F 被认为是A P 时的关键性炎性介质，A P 时血浆中P A F 显著升高m 1 。1 9 9 2 年T o m a s z e w s k a 等人经兔十二指肠上动脉注入不同剂量的P A F ，诱导出与剂量有关、不同程度的胰腺病理变化的胰腺炎模型，证实了P A P “ 在急性胰腺炎发病过程中的作用。G K B 治疗急性胰腺炎的作用主要体现在“它是P A F 的特异拮抗剂”，。阻断了P A F 介导的炎性过程，从而对治疗胰腺炎有重要意义。1 9 8 8 年J a n c a r 首次将特异性P
10、A F 受体拮抗剂G K B用于免疫复合物诱导的鼠急性胰腺炎模型，明显缓解了胰腺水肿程度。1 9 9 4 年王兴鹏等啪3 发现，G K B 能通过改善肺的相对血流量和肺组织灌注量明显降低急性胰腺炎时的肺损伤；显著降低A P 大鼠死亡率，延长平均存活时间、降低血清淀粉酶活性、减轻胰腺病理损伤；显著降低胰腺组织C a + 含量和丙二醛( M D A ) 含量、超氧歧化酶( S O D ) 活性n 8 1 。冀振华等口钉制备比尔格猎犬胰腺炎模型时，发现G K B 抑制胰腺组织P A F 增长。N o r t h o v e r 等证实G K B 可缓解P A F 诱导的大鼠小肠微血管变化，对急性胰腺
11、炎时肠系膜微循环起保护作用。细菌从肠道经淋巴入血，被认为是急性胰腺炎后感染的主要因素，B e d i r l i 等汹1 发现G K B 能抑制急性胰腺炎时肠道细菌移植到胰腺和血液。总之G K B 治疗A P 的主要作用有：通过温州医学院硕士学位论文抗炎，保护巨噬细胞溶酶体膜的稳定性嗍、阻止氧自由基刺激中性粒细胞聚集1 ；保护肠道黏膜的微循环：减少炎性介质和血管活性物质的产生以及细胞内游离钙等H 。尽管胰腺是对P A F 非常敏感的组织，但是1 9 9 9 年B r e n t 等n 2 1 利用免疫组化和反转录P C R 技术对P A F 受体在胰腺进行定位定量时发现，只有在胰岛毛细血管内皮
12、细胞上发现大量的P A F 受体存在，在胰腺腺泡细胞上并未发现P A F 受体，但有实验证明胰腺炎时胰腺腺泡细胞内含有大量的P A F ，这说明P A F在胰腺腺泡细胞上并不是直接和其细胞膜受体结合导致胰酶释放、激活以及P A F合成增加的，而是通过其它途径如：是否存在胰腺腺泡细胞核P A P 受体，激活细胞膜和细胞核磷脂酶A 2 活性，促使腺泡细胞内P A F 合成增加，导致细胞内游离钙升高，进一步促进胰酶的激活和释放，如血清淀粉酶，并且促使游离钙离子向组织问隙移动，形成皂化斑。这对G K B 作为P A F 膜受体的特异性拮抗剂治疗急性胰腺炎的作用机制提出了挑战。8 其他作用8 1 抑制体
13、内活性介质一氧化氮的产生N o 是机体内源性或活性介质，同时也是一种内源性神经递质，N o 在许多病理和生理过程中起着双重作用。C h e u n g 等n 3 3 利用T 船一l ( ah u m a nm o n o c y t i cc e l l1 i n e ) 巨噬细胞和H U V E C ( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ) 探讨G K对N O 生成的影响，结果表明：G K A 、G K B 可通过抑制巨噬细胞内i N O Sm R N A 的表达而减少N 0 的形成，但不影响e N
14、 O S 介导的内皮细胞N O 产生，从而治疗因N o 失调导致的疾病。这些研究人员还发现合用G K A ，G K B 并不比单用产生的抑制作用强，提示G K A 和G K B 可能是通过相同的途径影响T H P - I 巨噬细胞中N o 的产生。此外，单用少量的萜类化合物( 0 2 5 1 O m g m L ) 就可产生与银杏叶提取物( E G b ，l O O m g m 1 ) 相同的抑制作用，其原因可能是E G b 中某些成分对N O S 表达的作用与G K A 、G K B 相反。“8 2 抑制外周苯二氮卓受体( P B R ) 对糖皮质激素的调控糖皮质激素过量可导致多种疾病。H
15、a k i m a 等n 们研究发现G K B 可降低P B R 的m R N A 、蛋白质及配体结合水平，最终导致皮质类固醇的减少。进一步研究证实：G K B 对P B R 表达的抑制作用是通过一个转录因子与- 6 3 6 - 6 1 6 P B R 启动子区结合所介导的。剔除或突变该序列可阻止该D N A 蛋白的相互作用，从而抑制P B R 基因转录。G K B 可减少Y ，肾上腺皮质细胞株中由- 6 2 4 - 5 1 3 D N A 序列驱动的报告基因的表达，而该序列又与P B R 编码基因的转录起始位点相关，但G K B 对由该报告基因表达所驱动的S V 4 0 启动子及细胞色素P 4 卯1 7 a 羟化酶基因启动子无影响。由此提示：G K B 通过特异性抑制肾上腺皮质P B R 基因的转录而减少糖皮质激素的产生。3 7温州医学院硕士
