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1、第三章 酶的分离纯化概述第一节 起始材料的选择第二节 细胞破碎第三节 酶的提取第四节 分离方法第五节 酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价复习题DateDate1 1分离方法分述n一、离心分离法n二、过滤与膜分离n三、沉淀分离法n四、层析分离法n五、电泳分离法n六、酶的结晶n七、浓缩与干燥DateDate2 2四、层析分离法n原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不 同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相 时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分 的目的。n吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混 合物中的各组分分离的方法。n离子交换层析：依据被分离物
2、质与分离介质间异种电荷的 静电引力的不同来进行物质分离的。n凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。 是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量 不同而进行分离的技术。n亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的 亲和力，使生物分子分离纯化的技术。DateDate3 3（一）吸附层析法n1、概念n吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使 混合物中的各组分分离的方法。图n2、吸附剂n硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例n一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附， 而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗 脱出来。3、吸附层析方法n吸附剂
3、可装在吸附柱上进行吸附柱层析；n把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加洗脱剂 ，使酶解吸而洗脱出来。n4、特点与应用n设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又 具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍 广泛应用的层析分离技术。 枯草杆菌枯草杆菌-淀粉酶在弱酸性条件下，淀粉酶在弱酸性条件下， 可吸附在可吸附在氧化铝氧化铝上，再用上，再用pH8pH89 9的的 Na3PO3Na3PO3溶液洗脱；中性蛋白酶可溶液洗脱；中性蛋白酶可 在在pH6.5pH6.58.58.5条件下，用条件下，用硅藻土硅藻土吸吸 附，再在附，再在pH9pH911.511.5的的2%2%氯化钠氯化钠 溶液中洗
4、脱出来。溶液中洗脱出来。DateDate4 4吸附层析法图DateDate5 5（二）离子交换层析n1、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引 力的不同来进行物质分离。 n2、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反 离子。羧甲基纤维素（CM-纤维素）：纤维素-O-CH2- COO-Na反离子 基质 电荷基团n3、离子交换剂的种类n4、离子交换剂的选择n5、离子交换层析的操作流程n6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存 、分辨率高、测定蛋白质的等电点。DateDate6 6离子交换原理图DateDate7 73、离子交换剂的种类基质电荷基团疏水性：人工合成的与水
5、结合力较小的树脂类物质，分离 小分子物质。大孔树脂可用于酶 。（离子交换树脂）亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。 （离子交换纤维素、离子交换凝胶）阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+） ，与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-）， 与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型常用的离子交换介（基）质 离子交换剂保存剂DateDate8 8亲水性离子交换剂n离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成， 亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大 ，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常 用的有DEAE-纤维素、AE-
6、纤维素、CMC（羧甲基纤维 素）等。n离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体 引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交 换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分 离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖 凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM 凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡 聚糖凝胶等。 DateDate9 9常用离子交换介质DateDate1010离子交换剂保存剂DateDate11114、离子交换剂的选择n强弱离子交换剂的选择： 强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。 弱型：适用范围窄，适合分离生
7、物大分子物质。酶蛋白的pI为6- 9时，考虑用强型离子交换剂。n基质的选择：分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。离子交换剂类型的选择离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性考虑酶的稳定性酶在酶在pH pH pIpI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；酶在酶在pH pH pIpI的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。DateDate12125、离子交换层析操作流程离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析；可将离子交换剂加到酶
8、液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。离子交换柱层析主要操作过程：（1）离子交换剂的处理与装柱（2）上柱（3）洗脱和收集 （4）离子交换剂的再生 DateDate1313（1）离子交换剂的处理与装柱n预处理：浸泡与脱气n将干燥的离子交换剂用水浸泡2h以上，充分吸水膨胀后 ，减压抽除气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清。再先 后用4倍体积左右的2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠 浸泡各4h，再用无离子水洗至中性。n转型n经上述处理后的离子交换剂需经转型，使离子交换剂所 带的可交换离子转变为适当的离子型。如阳离子交换剂 用NaOH处理，转为Na+型；用HCl处理，转为H
9、+型 。阴离子交换剂用NaOH处理成OH-型；用HCl处理成 Cl-型等。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以 重复使用。n装柱n转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对 分离效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹。 装好后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。 DateDate1414（2）上柱n样品液的控制：上柱时要注意酶液的pH值、温度和 离子强度等条件。n上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出 。当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶 液尽快均匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换 剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换 容量饱和为止。n
10、流速的控制：要控制好流速。流速太快，分离效果不 好；流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂 颗粒太细，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引 起流速太慢时，为加快离子交换层析速度，可采用在柱 进口适当加压或在出口适当减压的方法。 DateDate1515（3）洗脱和收集n 洗未吸附物n 上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附 的物质洗出。n 洗脱目标物n 用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲 和力自小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到 分离目的。n 若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分 离效果。为此，可采用连续或阶梯式的梯度洗脱法。即 采用按一定规律改变
11、pH值（pH值梯度）或盐浓度（浓度 梯度）的洗脱液进行洗脱。连续梯度洗脱液可按预先设 计的梯度范围，在梯度混合器中配置。而阶梯式梯度洗 脱液则分别配置几种不同pH值或不同盐浓度的缓冲液， 使用时按设计好次序依次洗脱。 DateDate1616（4）离子交换剂的再生n洗脱收集完毕后，为使离子交换剂再次使用，需要经过 再生处理。n含杂质较少时，再生只要用酸、碱或盐进行转型即可 ；n含杂质较多的情况下，再生时要先经过酸、碱浸泡清 洗，用水洗至中性，然后再转型，以备再次上柱进行交 换。如此循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的 时间。n 如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适 当的防腐剂以防
12、止微生物生长。阳离子交换树脂常用 0.02%的叠氮钠作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是10ppm的苯乙酸汞等。 DateDate1717（三）凝胶过滤层析n1、原理：依据分子筛效应，按分子的大小和形状来分离 样品。当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大 小和孔径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不 了颗粒内部而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比 ，流过柱的路程相对较短。n2、分配系数（Kd）：反映凝胶对溶质排阻程度的量。Kd值的意义Kd值的计算n3、凝胶种类：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝 胶n 常用凝胶过滤层析介质n4、影响凝胶过滤的因素：n5、凝胶过滤层析的应用：V
13、e-VoViKd=DateDate18181、凝胶过滤层析的原理DateDate19192、分配系数为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系 数Kd来量度。 Kd值值是反映凝胶对溶质排阻程度的量。Ve：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中 该组分出现高峰时所用洗脱液体积（mL）Vo：外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积（mL）Vi：内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积 (mL)DateDate2020（1）Kd值的意义nKd=0时 即Ve=Vo，该组分足够大，不能进入微孔，最先 流出。nKd=1时 即Ve=Vo+Vi，该组分可进入全部的微孔，最后流 出。n0Kd1
14、Kd小的先流出， Kd大的后流出。K Kd d可可定量定量地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。当。当K Kd d差异大时，分离效果好，差异大时，分离效果好， 差异小时，分离效果差。差异小时，分离效果差。Ve-VoViKd=DateDate2121（2）Kd值的计算nVe、Vo和Vi与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱 量的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的 凝胶柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后 ，在使用于酶液分离之前，通过试验，测定该层析柱的Vo 和Vi （图例） ， 并对某些已知组分的Ve进行测定，从而
15、计算出其Kd值。n n在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分 的Kd值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到 良好的分离效果。DateDate2222Vo和Vi 的测定n当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体 积和外水体积中的分布是不一样的。nVo ：溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网 孔内，如蓝色葡聚糖（blue dextran，分子量约2 000 000），而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的 洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kd=0)。nVi：溶液中的分子小于凝胶孔径下限者,（如T2O， tritium oxide，氧化氚，氚水）能自由
16、进入凝胶网孔 内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kd=1)。也可从凝胶干、湿重差求得。n而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则 能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之 间（Kd在01之间）。DateDate2323（1）葡聚糖凝胶n构成： 以葡聚糖（葡萄糖通过1，6糖苷键结合而成的线 性高分子）为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交联剂聚合而 成。Sephadex：G值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水 量的10倍。如：G-25表示1g凝胶可吸收2.5ml水。G值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离 ；G值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离 。n特点： 有良好的化学稳定性（耐酸碱）和热稳定性，室 温保存要防腐。葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发 生吸附作用。当离子强度大于0.05时吸附作用可丧失
