《生物化学》实验教学大纲

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1、生物化学实验教学大纲 适用专业：生物工程专业 课程类别：专业基础课程 课程性质：必修 实验类别：专业基础实验 一、学时与学分 1.课程总学时：48 2.课程总学分：1.5 3.实验学时：48 4.实验学分：1.5 二、实验教学目标与基本要求 通过本课程的教学使学生了解和掌握现代生物科学研究对本课程的需求， 了 解生物化学技术的基本原理、 方法和技能， 包括生物物质的性质鉴定、 含量测定、 生化分离技术的分离原理 （包括盐析、 等电点分离技术、 电泳技术、 色谱技术等） 、 分离纯化目的物质，以及对目的蛋白的鉴定和含量测定。通过学生的独立实验设 计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动

2、手能力，同时培养学生 的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 要求学生课前预习，实验过程中仔细观察，认真记录，课后作实验报告。 三、内容简介： 生物化学技术已经渗透到生物学的各个分支学科及医药农林的各个分支领域，并 正在迅速发展。 对生物化学实验技术的掌握已经成为这些学科在进行更高新水平研究、 揭示生命奥秘中的共同需求。希望通过本课程的教学，在全面介绍生物化学的基本技 术的同时，注重对反映当前生物学技术发展方向的新技术、新方法的介绍，激发学生 的学习热情，使学生全面掌握生物化学实验基本原理和技术，为培养基础扎实、适应 性强的生物技术人才奠定基础。 本实验课程教学主要围绕生物体的组成成分如：

3、 蛋 白质、糖、酶、核酸等生物大分子的基本性质，生物功能、分离提纯技术、分析 鉴定方法等方面入手，帮助学生掌握生物化学的基本实验方法和技能，在此基础 上对生物化学方法的应用和意义有一个整体的把握。 在可能的情况下让学生自行 设计和准备实验，培养其独立科研能力。学生两人一组进行实验，要求提交实验 报告或论文，在部分内容中可将上次实验结果作为下次实验的材料（若实验效果 欠佳，则使用其他组材料，但其成绩将受到影响） ，即通过相互联系的实验内容 的合理排，将所学实验技术串连起来，使学生对所学知识的相关性、实用性有个清醒的 认识和了解。 四、参考教材 主要教材： 生物化学实验原理和方法李建武等主编，北京

4、大学出版 1994 年 参考书籍： 基础生物化学实验王秀奇等主编，高等教育出版社，1999 年 生物化学与分子生物学实验技术历朝龙等主编，浙江大学出版社，1999 年 五、考核方式： 1通过学生的平时成绩进行考核。平时成绩包括实验预习、实验态度、实 验室常识、实验技能的掌握和实验报告等方面。给出对学生的基本综合评价。 2通过实验考试，考核学生的独立实验设计和实践过程，考核学生对实验 技术、基本理论和操作要领的掌握，给出对学生动手能力的评价。 3各部分成绩的比例如下： 1）考勤 10% 2）平时表现 （实验态度、实验室常识和操作等） 10% 3）实验报告 40% 4）实验考核 40% 六、实验设

5、备及器材配置： 可见光分光光度计、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、电子天平、凯氏定氮仪、 离心机、层析配套装置等。各种玻璃器材，如：凯氏定氮仪、蒸馏装置、试管、 离心管、锥形瓶、移液器、层析柱、研磨器等。 七、实验项目一览： 适用专业、年级 生物工程专业 2 年级 总学时/实验学时 48/48 序 号 实验项目名称 实验内容提要 学 时实 验 要 求实 验 类 型每组 人数 面向 专业 编号 备 注1 单糖的测定 邻甲苯胺法 通过本实验学习和掌握邻甲苯 胺法测定还原糖含量的原理和 方法 4 必 做验 证2 2 酶的影响因素 1.了解酶的特异性催化作 用，激活剂、抑制剂、pH、 温度对酶促反应的影响；

6、 2.学习淀粉酶活性定性鉴定 的原理和方法 4 必 做验 证2 3 肝脏中酮体的生 成 了解肝脏中酮体生成的原理 和操作技术 4 必 做验 证2 4 血清谷丙转氨酶 （GPT）活性测定 1.掌握血清谷丙转氨酶活力测 定的原理和方法； 2.学习如何设计实验，并检查 实验方法的可靠性回收率 测定。 4 必 做验 证2 5 醋酸纤维素薄膜 电泳分离乳酸脱 氢酶同工酶 1.复习有关同工酶的知识 2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分 离乳酸脱氢酶同工酶、底物染 色技术及有关原理 4 必 做验 证2 6 总氮量测定 微量凯氏定氮 法 学习凯氏定氮法的原理和操 作技术 8 必 做验 证5 7 血清清球蛋白质 的分离

7、提取及鉴 定和含量测定 1.了解设计一个综合性实验及 检验方法的完整思路过程； 2.对所设计的血清清球蛋白质 分离提取及纯度鉴定和含量测 定实验中所涉及的实验原理和 操作要熟悉并掌握。 12必 做综 合4 8 血红蛋白(Hb)的 分离提取及诱导 体形态的转换 1.了解 Hb 分离提取过程和 Hb诱导体形态调节的原理和 方法； 2.了解氧化型（oxy-Hb） 、还 原型（red-Hb） 、高铁氧化型 （met-Hb）的变化规律、光 谱学特征和颜色特点。 8 必 做综 合4 实验一 单糖的测定邻甲苯胺法实验一 单糖的测定邻甲苯胺法（验证性） （4 学时） 目的要求 1通过本实验学习和掌握邻甲苯胺法

8、测定单糖含量的原理和方法。 实验原理 血清中葡萄糖在冰醋酸中与邻甲苯胺共热， 葡萄糖先脱水转化成为 5 一羟甲 基一 2 一呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合成为蓝色的醛亚胺(Schiff 氏碱)其颜色的 深浅与葡萄糖含量成正比， 血清蛋白质则溶解在冰醋酸、 硼酸中故不会产生混浊。 + +H葡萄糖邻甲苯胺蓝色醛亚胺（希弗氏碱） 以空白管调节吸光度为零，测定各管A640值。 教学内容 1糖定量测定的意义。 2各种糖定量方法和原理及其优缺点。 3本方法特点、原理及需要注意的问题。 实验材料、试剂和仪器 1血清或其他含还原糖的样品 2O-TB试剂(O-T为邻甲苯胺，B为硼酸，O-TB为邻-甲苯胺-硼酸试剂)

9、 3 葡萄糖标准贮存液(10mgm1) 4可见光分光光度计；恒温水浴装置；中试管若干支；各种吸量管；滤纸 等。 实验二 酶的影响因素实验二 酶的影响因素（验证性） （4 学时） 目的要求 1. 了解酶的特异性催化作用，激活剂、抑制剂、pH、温度对酶促反应的影 响； 2. 学习淀粉酶活性定性鉴定的原理和方法 教学内容 1回忆影响酶促反应速度因素的种类和影响状况（专一性底物、pH、温度、激活 剂、抑制剂等） ； 2唾液淀粉酶鉴定原理和方法。 原理1 淀粉酶能催化淀粉水解，水解后生成的麦芽糖属于还原性糖，能使班氏试剂 中二价铜离子(Cu2+)还原成亚铜，生成砖红色的氧化亚铜(Cu2O)沉淀。淀粉酶不

10、 能催化蔗糖水解，所以不能产生具有还原性的葡萄糖和果糖，蔗糖本身又无还原 性，故不与班氏试剂产生颜色反应。 实验材料、试剂和仪器1 11淀粉溶液， 21蔗糖溶液 3pH6.8缓冲液 4班氏试剂 5稀释唾液， 6煮沸唾液 7稀碘液 原理2 唾液淀粉酶可催化淀粉逐渐水解，生成分子大小不同的糊精，最后水解成麦 芽糖。淀粉及糊精遇碘呈不同的颜色。直链淀粉(即可溶性淀粉)遇碘呈蓝色，糊 精按分子的大小遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色。最小的糊精和麦芽糖遇碘 不显色。根据颜色可以了解淀粉水解的程度。由于在不同温度、不同酸碱度下， 唾液淀粉酶的活性高低不同，所以淀粉被水解的程度也不一样。另外，有些物质 可作

11、为激活剂，提高酶活性；有些物质可作为抑制剂降低酶活性，也能影响淀粉 的水解程度。因此，通过与碘产生的颜色反应可以判断淀粉被水解的程度，从而 了解温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 实验材料、试剂和仪器2 l1淀粉溶液(同前) 2稀释唾液(同前) 3不同pH缓冲液 40.9%NaCI溶液 51%CuS04溶液 61%Na2S04溶液 7碘 液(同前) 器材：恒温水浴；沸水浴；冰浴；中试管、滴管等。 实验三 肝脏中酮体的生成 实验三 肝脏中酮体的生成 （验证性） （4 学时） 目的要求 了解肝脏中酮体生成的原理和操作技术 实验原理 利用丁酸作为底物，与肝组织匀浆（含有酮体生成酶系）保温后即

12、有酮体生成。酮体 可与含亚硝基铁氢化钠的显色粉反应产生红色化合物，而经同样处理的肌匀浆，则不 产生酮体，与显色粉作用不产生显色反应。 实验材料 肝匀浆和肌匀浆 试剂 1. 0.9氯化钠溶液 2. 洛克氏液 3. 0.5N 丁酸溶液 4. PH 7.6 1/15M 磷酸缓冲液 5. 显色粉 仪器 滴定管，试管，水浴箱 实验四 血清谷丙转氨酶（GPT）活性测定实验四 血清谷丙转氨酶（GPT）活性测定（验证性） （4学时） 目的要求 1 掌握血清谷丙转氨酶活力测定的原理和方法； 2 学习如何设计实验，并检查实验方法的可靠性回收率测定。 实验原理 实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经血清谷丙转氨酶作用生

13、成谷氨酸和丙酮 酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物在碱性条件下呈棕红 色。棕红色的深浅与标准进行比较，即可计算出酶的活性。 教学内容 1 血清谷丙转氨酶活性测定的意义； 2 此方法测定原理及注意的事项； 3 酶活性测定需非常严谨。 实验材料和用品 样品：动物血清； 试剂：1pH7.4的磷酸盐缓冲液； 2GPT 基质液； 3 2,4-二硝基苯肼；4丙酮 酸标准液； 器材：可见光分光度计； 恒温水浴槽； 移液管； 试管； 实验五 醋酸纤维素薄膜电泳分离乳酸脱氢酶同工酶实验五 醋酸纤维素薄膜电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（验证性） （4 学时） 目的要求 1. 复习有关同工酶的

14、知识 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理 实验原理 利用聚丙烯酰胺凝胶做支持物进行电泳，可将乳酸脱氢酶同工酶分离，由正极开始向 负极依次称为 LDH1,LDH2,LDH3,LDH4,LDH5,然后在此凝胶板上进行酶促反应,使 LDH 同工 酶区带着色，显色原理是以乳酸钠为基质，在 NAD+存在下处理电泳过的凝胶板，LDH可使乳酸脱氢酶生成丙酮酸，同时 NAD+还原成 NADH + H+NADH + H+通过 PMS 将氢传递给NBT,使其还原为不溶性紫色化合物，因此，在有LDH同工酶的区域即显紫蓝色。 试剂与仪器 1. PAGE 有关试剂 2. LDH 同

15、工酶染色贮存液 1） 氧化型辅酶溶液 2） 乳酸钠溶液 3） 氯化钠溶液 4） PMS溶液 5） NBT溶液 6） PH7.5 磷酸盐缓冲溶液 仪器 PAGE 电泳仪，枪和枪头，表面皿，烧杯， 移液管，滴定管，吸耳球。 实验六 总氮量测定微量凯氏定氮法实验六 总氮量测定微量凯氏定氮法（验证性） （8 学时） 目的要求 学习凯氏定氮法的原理和操作技术 实验原理 常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含 氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成 二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 此过程通常称为“消化” 。但是，这个反应进行的比较缓慢，通常需要 加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点， 并加入硫酸铜作为催化剂， 以促进反应的进行。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借 水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一