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1、 分类号V D C硕士学位论文醛糖还原酶抑制剂和杜仲木脂素对自发性高血压大鼠心血管重塑的影响E f f e c t so f a l d o s er e d u c t a s ei n h i b i t o ra n dl i g n a n sf r o mE u c o m m i aU l m o i d e sO l i v o nh y p e r t e n s i v ec a r d i o v a s c u l a r论文答辩日期r e m o d e l i n g作者姓名：谷娟学科专业：临床药理学院( 系、所) ：临床药理研究所指导教师：欧阳冬生副教授答辩委员会主
2、席中南大学2 0 10 年5 月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：兰她日期：坐年厶监学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位
3、论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：业年月名日中文摘要摘要醛糖还原酶属于还原型辅酶I I 依赖的醛酮还原酶超家族，以单体形式在体内广泛分布。对醛糖还原酶的研究始于糖尿病，以醛糖还原酶为靶点的醛糖还原酶抑制剂已成为临床上防治糖尿病并发症的有效药物。醛糖还原酶还参与了其他炎症和增殖性疾病的病理过程，抑制醛糖还原酶可抑制血管平滑肌细胞的增殖。杜仲木脂素是我们从杜仲中提取的杜仲降压作用的有效部位。我们预实验表明自发性高血压大鼠心肌醛糖还原酶活性增高，杜仲木脂素具有抑制醛糖还原酶活性的作用。原发性高血压，又称高血压病，是一
4、种炎症反应，血管平滑肌细胞增殖是高血压血管重塑的主要机制，因此，醛糖还原酶可能参与了高血压心血管重塑，抑制醛糖还原酶可能可以抑制高血压心血管重塑。目的：研究醛糖还原酶抑制剂依帕司他和杜仲木脂素对自发性高血压大鼠心血管重塑的影响。方法：8 N 龄雄性自发性高血压大鼠( S H R ) 4 8 只，预适应一周后测血压，然后，将其随机分为4 组( 每组1 2 只) ，分别灌胃给予卡托普利( 1 0 0m g k g d ) 、依帕司他( 10 0m g k g d ) 、杜仲木脂素( 3 0 0m g k g d ) 和自来水( 溶媒) ，每天一次，共1 6 周，灌胃总容量为1 0m l k g 。
5、另设同周龄同性别正常血压大鼠( W K Y ) 1 2 只，W K Y 灌胃给予自来水作为正常对照组。每周称体重1 次，根据体重调整给药剂量，每四周测一次血压。在大鼠2 4 周龄时做心脏B 超，2 6 周龄时麻醉后取出心脏、主动脉和肠系膜上动脉，测量心肌醛糖还原酶活性和检测上述组织醛糖还原酶表达和反映重塑的形态学指标。结果：( 1 ) 高血压未给药组( S H R ) 心肌A R 活性和蛋白表达高于正常血压组( W K Y ) ( P 9 8 )R O T H E 公司N A D P ( 纯度 9 0 )R O T H E 公司D L 甘油醛( 纯度 9 8 )S l G M A 公司B r
6、a d f o r d 法蛋白测定试剂盒碧云天P r o t e a s eI n h i b i t o rC o c k t a i lS e tII IM E R C K 公司其它常用试剂均为国产分析纯2 3 溶液配制N A D P H ( 2 5 m M )2 4 m gN A D P H ( 纯度 9 8 ) 溶于1 2 m l 去离子水中，4 。C 避光贮存N A D P ( 2 5 m M )2 4 m gN A D P ( 纯度 9 0 ) 溶于1 2 m l 去离子水中，4 避光贮存D L 甘油醛( 2 m M )取D L 一甘油醛5 m g 溶于2 7 8 m l 去离子水
7、中，4 贮存D L 一甘油醛( 4 0 m M )取D L 甘油醛1 0 0m g 溶于2 7 8 m l 去离子水中，4o c 贮存硫酸铵( 2 M )2 6 9 硫酸铵溶于1 0 m l 去离子水中，4 贮存H C I ( 0 5 M )3 m I3 6 H C I 用去离子水稀释到6 0 m l3硕士学位论文第二章仪器、试剂、溶液配制高氯酸( 6 ) 4 m l7 0 高氯酸用去离子水稀释到5 0 m l ，避光贮存N a O H ( 6 M )2 4 9N a O H 溶于1 0 0 m l 去离子水中，避光贮存磷酸钾缓冲液先配制1MK 2 H P 0 4 3 H 2 0 ( 2 2
8、8 9K 2 H P 0 4 3 H 2 0( 0 1 M P H = 6 0 )溶于1 0 m l 去离子水中) 和1 MK H 2 P 0 4 ( 6 8 9K H 2 P 0 4 溶于5 0 m l 去离子水中) ，然后量取6 6 m l1MK 2 H P 0 4 3 H 2 0 与4 3 4 m l1MK H 2 P 0 4 均匀混合P B S ( 0 2 M P H = 先配制0 2 MN a 2 H P 0 4 1 2 H 2 0( 3 5 8 97 4 )K 2 H P 0 4 - 1 2 H 2 0 溶于5 0 m l 去离子水中) 和0 2 MN a H 2 P 0 4 2
9、H 2 0 ( 1 5 6 9K H 2 P 0 4 溶于5 0 m l 去离子水中) ，然后量取8 1m 10 2 MN a 2 H P 0 4 1 2 H 2 0与19 m 10 2 MN a H 2 P 0 4 2 H 2 0 均匀混合4硕士学位论文第三章实验动物和实验方法第三章实验动物和实验方法3 1 实验动物W K Y 大鼠上海实验动物中心，雄性，8 周龄，每4 只放在金属饲养笼中饲养。饲养条件：室内温度2 5 1 ，自由饮食及饮水。试验前适应环境及尾动脉测压操作1 周。S H R 大鼠北京维通利华实验动物有限公司，雄性，8 周龄，每4 只放在金属饲养笼中饲养。饲养条件：室内温度2
10、5 1 ，自由饮食及饮水。试验前适应环境及尾动脉测压操作1 周。3 2 实验方法3 2 1 分组8 周龄雄性自发性高血压大N ( S H R ) 4 8 只，随机分为4 组，每组1 2 只，分别设为S H R 卡托普利组、S H R + 依帕司他组、S H R + 杜仲木脂素组和S H R 阴性对照组，另设同年龄同性别W K Y 大鼠1 2 只作为正常对照组。3 2 2 给药随机分组后灌胃给药，蒸馏水溶解，每日一次，灌胃容量1 0 m l k g ，给药剂量：依帕司他6 0 m g k g d ，杜仲木脂素3 0 0 m g k g d ，卡托普利10 0m g k g d ，对照组灌胃给予的
11、蒸馏水。每周称体重，根据体重调整给药剂量。3 2 3 尾动脉血压测量血压每四周测量一次，大鼠血压测量使用无创血压测量分析系统。具体步骤如下：( 1 ) 链接电脑、无创血压测量分析系统软件的电源。( 2 ) 打开无创血压测量分析系统主机和恒温箱开关，调节恒温箱的温度到3 4o C ，打开电脑，点击无创血压测量分析系统桌面快捷方式，打开系统软件。( 3 ) 将动物头向前装入鼠笼，用涂有润滑剂( 如肥皂水) 的鼠尾导引管将鼠尾穿过尾固定器孔，固定好，然后将脉搏传感器感应面( 有个圆形小胶块的一面)向上插入插孔，插入后要往里推到底，以保证传感器位置正确。硕士学位论文第三章实验动物和实验方法( 4 )
12、观察脉搏：单击显示区左下角“播放”键，即开始采样显示各通道的波形，如果要停止观察，单击右侧的“停止”键，观察到良好的脉搏波形后，自动或人工充放气，阻断脉搏。重复4 6 次，每次间隔不小于1 0 秒。( 5 ) 结果报告：点击“数据”菜单下的“当前数据报告”或工具栏的“当前数据”图标，得到当前测定结果报告( 包括收缩压、舒张压、平均动脉压、心率) 。( 6 ) 保存当前数据报告。3 2 4 心脏B 超的测量第2 4 周龄时做大鼠心脏B 超，观察心功能及心室重塑指标。使用V i V i d7G E回波心动描记器。腹腔麻醉后，仰卧位固定在大鼠固定板上，用剃毛机剔去大鼠胸部毛发，开始测量。记录收缩末期
13、和舒张末期的左室内径、左室后壁厚度、室间隔厚度、射血分数和左室缩短分数。3 2 5S H R 大鼠与W K Y 大鼠红细胞A R 活性( 1 ) 标本收集：2 6 周龄时，1 0 水合氯醛麻醉后，颈动脉插管采血2 m l 。( 2 ) 红细胞A R 活性测定，具体步骤如下：1 )取血、分离、洗涤红细胞：采血1m I ，肝素抗凝血3 0 0 0 r p m x l o m i n 分离红细胞，然后加4 倍体积4 预冷的生理盐水，3 0 0 0 r p m x l o m i n x 3 t i m e s 离心洗涤红细胞，2 0 冻存2 )裂解红细胞：冻存红细胞加4 倍体积的1 0 m M 磷酸
14、钾缓冲液( P H 6 0 ) ，振荡溶解1 0 m i n 。3 0 0 0 r p mx1 0 m i n ，去沉淀。3 )醛糖还原酶活性测定反应体系：每份样品一式三份，冰上操作，反应体系( 终浓度) ：1 3 5 m MP B S ，1 0 0 m M 硫酸铵，0 0 4 m MD L 甘油醛，1 5 0 u MN A D P H ，5 u L红细胞溶血液，总体积2 0 0 u L 。实验管加上述所有试剂，空白管以去离子水代替N A D P H ，加入D L 甘油醛后立即3 7 水浴反应。4 )终止反应：5 m i n 后，加入6 0 0 u L 0 5 MH C L 后6 0 水浴1
15、5 m i n 来终止反应并破坏反应剩余的N A D P H 。5 )沉淀血红蛋白：冰浴冷却后加入2 5 0 u L 6 的高氯酸3 0 0 0 巾m x l0 m i n 离心沉淀血红蛋白，吸上清1 m L ，2 0 冻存。6 )荧光值测定：冰浴冷却后，加入2 m L 6MN a O H ( 内含1 0 m M 咪唑) 3 7 。C 水浴3 0 m i n 激发N A D P 产生荧光。E x 3 6 0 m n E m 4 6 0 n m 钡J J 定荧光强度。7 )血红蛋白含量测定：用血红蛋白测定仪6硕士学位论文第三章实验动物和实验方法8 )绘制标准曲线并计算A R 活性：反应体系与条件
16、同上，去离子水代替红细胞溶血液，N A D P ( 0 1 0 0 0 u M ) 代替N A D P H ，以N A D P 浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标做标准曲线，求回归方程。由方程求得N A D P 生成量，每分钟产生1I J m o lN A D P 为1 个酶活性单位( U ) 。计算A R 活性，单位U m g H b 。3 2 6S H R 大鼠与W K Y 大鼠左心室A R 活性( 1 ) 标本收集：2 6 周龄时，10 水合氯醛麻醉后，取出心脏后预冷的生理盐水冲洗，去除心房及右心室组织，保留左心室及室间隔( 冰上操作) ，剪去心尖一小块组织( 尽可能少一些够用就行，注意每个标本的取材部位的可比性) 放入1 0 甲醛液固定液待做切片进行心室重构形态学观察及免疫组化，剩余的剪成两部分，一小部分放入电镜液中做电镜，另一部分直接放入液氮，然后转到7 0 “
