《流感疫苗对慢性粒细胞白血病源性树突状细胞功能影响的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流感疫苗对慢性粒细胞白血病源性树突状细胞功能影响的研究（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：垒是日期：型竺关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导I - N 完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、饺用学位论文的规定，吲意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅
2、；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与凌论文赢接相关的学术论文或成果时，第署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：盘曼导师签名：i 蛊受蔓日期：盟：三?兰州大学硕士学位论文月U茜树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，D C ) 是目前已知体内功能最强的抗原递呈细胞( a n t i g e n - p r e s e n t i n gc e l l ，A P C ) ，能通过摄取、加工处理和递呈内、外源性抗原以及上调共刺激分子而
3、有效激活初始型T 细胞( N a i v eT ) ，促进C D 8 + 细胞毒T 淋巴细胞( c y t o t o x i cTl y m p h o e y t ，C T L ) 及C D 4 + 辅助性T 细胞( T h ) 的生成，同时也能促进B细胞增殖并产生抗体，是机体免疫应答强有力的启动者和调节者f 1 翻，因此，D C 在抗肿瘤免疫中具有中心地位和桥梁作用。近年来基于D C 的诱导扩增和抗肿瘤免疫成为广泛关注的焦点并得到了深入研究。D C 主要来源于骨髓造血干细胞，在体内分布广泛，普遍存在于除脑组织外的各种组织和器官中，在遇到外来抗原时可捕获、处理抗原。但是它的数量极少，外周血
4、单个核细胞中D C 的比例还不到l ，在淋巴器官中虽数量较多却难以收集，而且由于分离出的D C 具有异质性，难以满足对D C 的基础研究及临床应用的需要。此外，肿瘤患者体内的D C 因为肿瘤本身分泌的细胞因子，如I L 1 0 ，T G F ，V E G F 限制其成熟而发生功能缺陷。因此，需要利用D C 的前体细胞进行体外诱导分化扩增。目前，D C 通常是从骨髓、脐血和外周血C D 3 4 + ；i t I l i l 祖细胞【3 4 1 或C D l 4 十单核细胞t s 及白血病细胞同经不同的细胞因子组合诱导生成。在诱导D C 生成中已获肯定的细胞因子有：G M C S F 、I L 4
5、 、T N F d 、S C F 和I L - 3 等。随着D C 功能研究及培养扩增技术不断完善，体外实验和动物实验应用肿瘤抗原致敏的D C 得到令人瞩目的抗肿瘤效应后，临床试验工作也逐步开展。从19 9 6 年首次报道树突状细胞疫苗应用于肿瘤患者至今，国外已有美国、瑞士、英国等数国多家机构开兰州大学硕士学位论文展了这一工作，并积累了一定数量的临床I 、1 I 期试验病例【7 】。他们采用的疫苗形式有合成多肽、抗独特型抗体、H L A 多肽及肿瘤细胞冻融物等，治疗的病种包括非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、恶性黑色索瘤、多发性骨髓瘤以及肺癌等。肿瘤特异性抗原的存在及D C 的有效成熟是D C 疫苗广
6、泛应用于临床的关键。对于血液系统肿瘤，目前利用自血病细胞自身可成功诱导分化为D C ，因其携带有自体已知或未知的多个肿瘤抗原丽具有独特优势，但如何刺激它成熟、提高抗原递呈能力仍是困惑实验学家及临床学家的棘手难题。一般来说，D C 的培养过程分为两个阶段 8 1 ：启动培养和分化培养。己证明在传统的G M - C S F 和I L _ 4 细胞因子培养条件下2 - - 3 周可产生成熟D C ( m a t u r e d e n d r i t i cc e l l ，mD C ) ，但以此种方法获得的D C 已接近或达到衰老状态，功能减退，不能有效递呈抗原限制了其临床应用。故有人提出在应用G
7、 M C S F 和I L 4 经典细胞因子诱导出非成熟D C( i m m a t u r ed e n d r i t i cc e l l ，iD C ) 的基础上( 7 天左右) ，再使用成熟诱导因子促使其成熟从而有效激活针对肿瘤的特异性C T L 。目前证明的促成熟因子有：细菌菌体或其产物，如L P S ；某些病毒或其核酸；某些有炎症介质作用的细胞因子，如T N F n ；某些刺激信号；单核细胞条件培养液；氧自由基供体过氧化氢【9 l 。不同的D C 成熟诱导方案可产生不同的D C 集落，他们在表型、细胞因子分泌特征、迁移到淋巴结的能力，以及与T 细胞相互作用的能力都可能不同，而这些
8、都是引发有效的免疫应答所不可缺少的因素。目前，各实验室应用不同细胞因子组合所得的结果不尽相同，未达到令人满意的效果。而且由于获取困难，价格昂贵，副反应较大及安全性问题使这些促成熟因子在临床应用中受限。能否找到一种最佳的佐剂来刺激D C 成熟一直是实验学家探索的课题。人们发现流感病毒除可引起体液免疫反应外，在增强细胞免疫方面也有良好的作用，大多数来自人2兰州大学硕士学位论文类血液的D C 可被流感病毒感染并持续递呈抗原肽【1 0 】，促进T 细胞增殖。S c h u m a c h e r等。州研究证实：重组的流感疫茵病毒体( I m m t m o p o t e n t i a t i n
9、gr e c o n s t i t u t e dI n f l u e n z av i r o s o m e s ，I R I V ) 在体外能活化C D 4 C D 4 5 R O + T 细胞，诱导细胞因予I F N 7 、G M - C S F 、T N F a 产生，刺激T h l 并增加C D 4 + T 细胞表达C X C R 3 。他们推测 R I V 可刺激外周血单个核细胞( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l ，P B M N C ) 分泌细胞因子诱导D C 成熟，从而递呈抗原，达到最佳的C
10、 T L 效应。L o p e z 掣1 2 1 发现失活的流感病毒感染D C 后能通过分泌大量的I L 4 等T h 2 型细胞因子而影响D C 的成熟。Y u n j t m gC h o 等0 1 3 1 证明热灭活的非感染性流感病毒可以产生更强的C D 8 + T 淋巴细胞毒性反应，推测其机制可能与灭活的流感病毒激活D C ，增强其抗原递呈功能有关。研究还发现流感疫苗接种人体后也具有诱发体液免疫和细胞免疫的作用，而且细胞免疫先于体液免疫发生【1 4 1 。最近国外报道1 5 1 与传统的肌肉注射相比，皮下注射小剂量流感疫苗( 1 5 量) m l - I 获得足够的抗病毒效应，推测其机
11、制与细胞免疫有关。而且有报道，流感疫苗可刺激老年人衰老的T 细胞 1 6 1 及肿瘤患者功能缺陷的T 细胞增殖和I F N Y 产生增加。这些发现要求我们回答：流感疫苗增强细胞免疫的机制是什么? 它是通过何种途径激活T 细胞的?基于上述研究，我们推测：流感疫苗作为流感病毒的灭活产物，含有全部或部分的流感病毒抗原成分，可能具有刺激D C 成熟，并通过影响D C 的成熟而产生积极细胞免疫的作用。为此，本实验拟应用慢性粒细胞白血病( c h r o n i cm y d o i dl e u k e m i a ，C M L )源性树突状细胞作为研究对象，观察流感病毒疫苗对其表面分子和所分泌细胞因子
12、的影响，来探讨流感疫苗对已负载肿瘤抗原D C 的作用，为D C 疫苗的研究提供一条全新有效、简便可行的新道路。兰州大学硕士学位论文材料和方法1 研究对象选择的8 例病例均为兰大二院血液科初诊未治的C I V I L 慢性期住院患者。其中男6例，女2 例，年龄为3 5 - 6 2 岁，平均5 0 8 6 5 岁，临床表现、血象、骨髓象符合C M L慢性期诊断标准，染色体核型检查P h i 阳性( 阳性率均为1 0 0 ) 。2 观察指标( 1 ) 光镜下观察D C 形态；( 2 ) 骨髓单个核细胞( b o n em a r r o wm o n o n u c l c a rc e l l ，
13、B M M N C ) 培养7 天后检测染色体核型以确定慢粒源性；( 3 ) 流式细胞仪检测收获细胞的表型( C D l a 、C D 5 4 、C D 8 3 、C D 8 6 和H L A - D R ) ：( 4 ) E L l S A 法测定1 L 1 2 的浓度。3 试；f l j 、材料和仪器3 1 试剂R P M I - 1 6 4 0 粉剂美国H y c l o n e 公司胎牛血清( 8 月龄健康胎牛)杭州四季青生物工程材料研究所淋巴细胞分离液上海华精生物高科技有限公司r h G M C S F美国先灵葆雅药厂r h l L 一4 、r h ，T N F a晶美生物工程有限公
14、司1 多聚甲醛自配免疫吸附磁珠C D l a 单抗C o u l t e rI m m t m o t e e b 公司抗人C D l a - P E 、C D 5 4 F I T C 、C D 8 3 F I T C 、C D 8 6 - P E 、H L A 。D R H T C 单抗为4兰州大学硕士学位论文I m m u n o t e c h 公司产品。完整的失活流感疫苗( w h o l ei n a c t i v a t e di n f l u e n z av a c c i n e ，w r y ) ( 含甲l 型、甲3 型和乙型之当前流行株流感病毒) ，为兰州生物制品研究
15、所产品：裂解流感疫苗( s p l i ti n f l u e n z a v a c c i n e ，S I V ) 含甲福建，4 1 1 2 0 0 2 ( H 3 N 2 ) 类似株【变异甲，怀饿踱3 2 0 0 3 ( X - 1 4 7 ) 1 ；甲新喀里多尼亚d 2 0 9 9 ( H l N I ) 类1 以株【变异甲新喀里多尼亚，2 0 9 9 3 ( I V R - 1 1 6 ) 】：乙，上海，3 6 1 2 0 0 2 类似株f 变异乙江苏1 0 2 0 0 3 为葛兰素史克生物制品公司产品。3 2 仪器与材料B B 5 0 6 0 B B l 6C 0 2 孵箱H
16、e r a e u s 公司超净工作台江苏南通农业科学仪器厂离心机北京医用离心机厂O l y m p u s 倒置显微镜日本O l y m p u s 公司W e l l s c a nM K 3 酶标仪L a b s y s t e m sD r a g o n 公司A G l 3 5 电子天平M e t t l e r T o l e d o 公司F A C S C a l i b u r 流式细胞仪B e c t o nD i c k i n s o n 公司I L 1 2 E L I S A K I T晶美生物工程有限公司M A C S 免疫磁珠分离仪基因公司微量加样器，微孔滤膜( 0 2 2 u r n ) ，1 0 m l 、2 0 m l 离心管，细胞计数板，1 2 孔、2 4孔培养板等。4 实验方法4 1 骨髓单个核细胞的分离：采集初诊未治的C I V I L 患者骨髓4 6 m i ( 4 0 u m l 肝素抗凝) 加等体积的P B
