单核细胞增生性李斯特氏菌种、株随机扩增dna多态性研究

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1、中国医科大学硕士学位论文单核细胞增生性李斯特氏菌种、株随机扩增DNA多态性研究姓名：金莉莉申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：王海鹏2001.4.1中 文 摘 要/前言单核 细 胞 增生 性 李 斯 特氏 菌( L i s te ri a m o n o c y t o g e n e s 简 称 单 增 李氏菌， L . m ) 是重要的食源性致病菌， 人类生活的主要食品诸如 蛋、 奶制品和肉类食品是该菌的主要传播媒介。近年， 一些国家和 地区不断发生食源性李斯特病的 爆发流行。 该菌在自 然界中广泛 分布， 因此李斯特氏菌种间及种内鉴定、 分类具有重要意义。李斯特氏菌属内的6 个种

2、中， 只有单增李氏菌对人有致病性。 目 前， 李斯特氏菌种间分类、 鉴定一直采用依据表型特征而建立的 生化测试方法， 耗时1 一 2 周， 且属内的单增李氏菌和英诺克李氏 菌( L . i n n o c u a ) 因二者生化反应完全相同难以区分。依据s e e l i g e ri 的 血清学法， 李斯特氏菌属共有1 6 个血清型， 但由于9 0 %的李斯 特病例仅由血清型1 / 2 a , 1 / 2 b , 4 b 的单增李氏菌引起， 因此血清型 在流 行病学中的意义是有限的。随着分子生物学和分子遗传学技 术的应用， 不同的实验室先后对单增李氏菌种、 株进行限制性酶切 片 段 长 度

3、多 态 性 分 析 ( 二 ) 和 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 等 研 究 。 这 些 丫 法较传统的表型方法具有鉴别力强、 时间短等特点， 但仍存在着一 些不足之处， 如分析的基因组区域小、 操作较繁琐等。 随机扩增多态性D N A ( R A P D ) 是由W e ls h 和W i ll i a m s 1 9 9 0 年 先后创立的一种新的D N A遗传标记， 能够测基因组D N A 的多态性并进行种、 株的鉴定和分类等研究实验欲利用单一 及双引物组合的复合引物对5 株单增李氏 菌和1 株英诺克李氏菌 进行R A P D研究。通过对扩增产物的定性、 定量分析， 寻找出有意 义的种、

4、株特异性指纹图谱， 并结合数值分析对6 株李斯特氏菌进 行基因 分型研究， 为单增李氏菌种、 株进一步的鉴定、 和分型莫定1一 钾 ， ， ， ， ， ， ， ，. . . . . . . . . . . . . . 口 . . . . . . ， . 口.一一 . . . .引一 ，种 . . . 月 ， 一基础。/方法l琢 单 一 及 双 弓 !物 组 合 的 复 合 引 物 对 5 株 单 增 李 氏 菌 和 1 株 英诺 克 季 氏 菌 基 因 组D N A 进 行 扩 增， 扩 增 产 物 经1 % 的 琼 脂 糖电 泳 分离， E B染色， 在 G D S 8 0 0 0 紫外分析

5、仪上照相， 以D L 2 0 0 0 + D L 1 5 0 0 0 作为分子量标准， 求出随机扩增D N A片段的长度， 资料 分析用两种方法， 定性方式: 以每株单增李氏菌各株特异的扩增图 谱作为鉴别标志， 区分不同的单增李氏菌株， 并以同种单增李氏菌 全部个体均出现的保守的种特异性扩增片段作为单增李氏菌种的 鉴别标志。定量分析: 根据N e i s 相似性系数对扩增产物作定量 分 析: S I = 2 N 了( N , + N , ) , S T 为x 株 和y 株 的 遗 传 相 似 率， N x y 为 扩增带相同的数量， N x 和N y 分别为x 株和y 株各自 扩增带的数 量。

6、 将多态片段共享度用S A S E . 0 4 中的U P G M A 方法进行聚类 分析。结果单一及复合引物扩增产生的1 0 组D N A指纹图谱中， 共得到 1 4 0 条多态片段， 其中单增李氏菌与英诺克李氏菌种间共有片段6 条， 单增 李氏 菌种内5 株菌共有片段5 条。 单一引物P 一 0 3 , P - 0 9和组合引物 P O I P 0 3 , P 0 3 P O 6 , P 0 4 P 0 6 , P 0 4 P O 9扩增所得到的 D N A指纹图谱可清楚的显示出李斯特氏菌种、 株间的差异， 同时 也具有种属同源性。复合引物P 0 1 P O 3 , P O 3 P O 6

7、 能够直接扩增得 到单增李氏 菌和英诺克李氏菌种间、 单增李氏菌种及种内株间各 株的特异片段， 对单增李斯特氏菌种株鉴别更有效。相似性系数和聚类分析得到如下结果: 单增李氏菌与英诺克李氏菌种间的相似性系数最小， 为0 . 2 8 3 一 0 . 3 3 9 ; 其次为血清型 4 b 型单增李氏菌与种内其它4 株李斯特氏菌相似性系数为0 . 3 9 7 - 0 . 4 1 9 ; 菌株A , C , B , E亲缘关系较近， 相似性系数为0 . 6 4 1 - 0 . 8 6 7 。从聚类分析结果也可看出菌株A , C首先和B , E聚为一 类， 再与菌株D聚为一类， 最后再与英诺克李氏菌F 聚

8、为一类。讨论1 . R A P D 分析在单增李氏菌种、 株鉴定上的实用性目 前， 单增李氏菌种、 株的鉴定一直是一个尚未得到较好解决 的间题， 本实验应用单一引物及随机组合的复合引物对5 株单增 李氏菌和1 株英诺克李氏菌进行R A P D研究， 得到一系列稳定的 重复性较好的D N A指纹图谱。单一引物P - 0 3 , P 一 0 9 及复合引 物P 0 1 P 0 3 , P O 3 P O 4 、 和P 0 4 P 0 9 的扩增产物均能显示出6 株李斯特 氏菌的D N A多态性， 同时又通过共同 扩增带的存在， 证明六株菌 具有种属同源性。对5 株单增李氏菌和1 株英诺克李氏菌多态

9、性研究表明， 通 过选用的单一及复合引物扩增， 5 株单增李氏菌和1 株英诺克李 氏菌反应所得到完全不同的D N A指纹图谱， 代表了不同李斯特氏 菌具有的自 身特性。如在本实验所使用的单一及复合引物扩增结 果中， 英诺克李氏菌的R A P D扩增片段少于5 株单增李氏菌。在 单增李氏菌种内 各株间， D株( 血清型4 b ) 为主要流行型菌， 与其 它4 株单增李氏菌相比， 具有较多不同的多态位点， 这可能与4 b 型菌自身的流行特点相关。如用引物 P 0 1 P 0 3扩增， 1 8 2 0 饰、 8 3 1 饰, 4 2 7 如的 扩 增片 段为4 b 株 特有， 而 在 其 它4 株

10、单增李氏 菌 中无上述片段。这将为今后4 b 型菌的流行特点研究提供一定的 依据。本实验通过选用的单一及复合引物扩增， 所得特异指纹图谱 3一份一 一- 一一. -户种.曰， . . . . . . . . 口 . . . . . . . 一.川.一一一显示了 单增李氏菌种内 株间的多态性， 适用于种内 不同株的 鉴定。 并进一步通过具有单增李氏菌种鉴定意义的特异片段的筛选， 可 以在单增李氏菌种水平上进行鉴定， 弥补了引物不足带来的缺欠。 本实验通过6 条单一引物及5 组复合引物的扩增， 共筛选出单增 李氏菌种特异片段6 条， 在现有的研究范围内， 初步认为这些特异 性片段具有单增李氏菌种的

11、特异性。可以用于单增李氏菌种的鉴 定。由此可见， 根据特异性的D N A指纹图谱， 能在2 4 h内对单增 李氏菌种、 株进行鉴定， 方法简单， 快速而准确。在所用的引物中， 复合引物P 0 1 P 0 3 , P O 3 P O 6 能够直接扩增得 到单增李氏菌和英诺克李氏菌种间、 单增李氏菌种及种内株间的 共有片段和特异片 段， 即能反应李斯特氏菌种、 株多态性又能体现 李斯特氏菌的种、 属同源性， 对单增李斯特氏菌种株鉴别更有效。2 . R A P D 基因组多态性在李斯特氏菌分类上的意义数值分类是近年来提出的新的分类法， 将实验结果量化后分 类， 可以 更准确地衡量物种之间的亲缘关系，

12、 根据R A P D指纹图谱 用相似性系数和聚类分析的方法， 对5 株单增李氏菌及一株英诺 克李氏菌进行分类， 参照聚类分析结果， 分别得到相似性系数 ( S i ) 小于0 . 3 3 9 , 0 . 3 9 7 一 0 . 4 1 9 、 大于0 . 6 4 1 的三个级别的数据。 为这些菌种株之间亲缘性关系的 研究提供了一定的依据。从聚类 分析和相似性系数结果可以看出， 5 株单增李氏菌与英诺克李氏 菌亲缘关系最小， 说明二者在基因水平上已有明显分化， 这将为研 究单增李氏菌的致病机制及寻找与致病相关的分子标记提供依 据。单增李氏菌主要流行型4 b 型菌明显不同于种内其它成员的 单增李氏

13、菌( S I : O . 3 9 7 一 0 . 4 1 9 ) ， 这与C a r r i e r e 用P F G E 方法对单 增李氏菌基因多态性进行研究所得的结果一致， C a r r i e r e 发现， 4 b 型在进化的过程中相对保守， 而其它菌株趋于变异。尤为值得注 意的是， 菌株C和菌株B血清型同为3 a 型， 但分析结果却表明它 们的 遗传距离相对较远， 因此该方法亦可用于区分不同来源的李4 Wi le s 株 ，可 对 A M 的 好9 f7 A * A f7 W A 犷 一了 一结论 :1 、 根据特异性的R A P D指纹图谱能在2 4 小时内对单增李氏 菌种、 株

14、进行快速而准确的鉴定。2 、 复合引物P 0 1 P 0 3 , P O 3 P O 6 能够直接扩增得到单增李氏菌 和英诺克李氏菌种间、 单增李氏菌种及种内株间的共有片段和特 异片段， 即能反应李斯特氏菌种、 株多态性又能体现李斯特氏菌的 种、 属同源性， 对李斯特氏菌种株鉴别更有效。3 、 致病的单增李氏 菌和非致病的英诺克李氏菌在基因水平上 已 有 明 显 分 化 9- * 为 研 究 单 增 李 氏 菌 的 致 病 机 制 及 寻 找 与 致 病相 关 的 分 子 标 记 提 供 依 据 。 J 尸一 V4 , R A P D图谱结合数值分类， 可对李斯特氏菌种株正确分类， 并可在一定

15、程度上反映出李斯特氏 菌D N A的同源程度， 由 此可根 据菌株的R A P D图谱确定其感染来源。关键词: 单核细胞增生性李斯特氏菌; R A P D ; D N A指纹图谱; 相似性系数分析; 聚类分析A S t u d yOnO f S p e c i e s A n d S t r a i n s I n T h e G e n u s L i s t e r i a R a n d o m A m p l i fi e d D N A P o l y m o r p h i s m sAB S TR ACTPr e f a c eL i s t e r i a m o n o c

16、y t o g e n e s i s r e c o g n i z e d a s a f o o d b r o n g p a t h o g e n w i th a n i m p o rt a n t p u b l i c h e a l t h s i g n i f i c a n c e . I t h a s b e e n i n v o l v e d i n s e v e r a l o u t b r e a k o f l i s t e r i o s i s i n s o m e c o u n t ry s i n th e p a s t d e c a d e . T h e u b i q u i ty o f L . m o n o c y t o g e n e s m a k e i d e n t i f i c a ti o n a n d t y p i n g m e th o d s e s s e n ti a l f o r s e