《基质金属蛋白酶-12（mmp-12）在子宫内膜癌中的表达及其意义硕士论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基质金属蛋白酶-12（mmp-12）在子宫内膜癌中的表达及其意义硕士论文（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Y9 3 5 2 9 9-舟类号：密鹱：u D c ：论支蝙号：硕士学位论 M A S T E RT H E S l S文基质金属蛋白酶一1 2 ( M M P 1 2 ) 在子宫内膜癌中的表达及其意义董燕大连医科大学独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：重量签字日期：墨生妇L 日学位论文版权使用
2、授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：垂堡z 指导教师签名：主E 墨查 签字日期：之兰年j 月上日基质金属蛋白酶一1 2 ( M M P 1 2 ) 在子宫内膜癌中的表达及其意义硕士研究生指导教师：指导小组：专业名称：董燕 邓燕杰教授 燕秋教授妇产科学摘要目的通过研究基质金属蛋白酶一1 2 ( M M P 1 2 )
3、在子宫内膜癌中的表达，探讨其与子宫内膜癌浸润转移的关系。方法研究对象：取4 2 例子宫内膜癌患者的标本经病理证实均为子宫内膜样腺癌作为研究组；取同期因异常阴道流血行诊断性刮宫病理证实为子宫内膜不典型增生1 2 例，同期因子宫肌瘤行子宫切除术的正常子宫内膜1 2 例作为对照组。所有病例术前均无化疗、放疗及激素治疗史。实验方法：( 1 ) 应用免疫组织化学方法( S P 法) 对4 2 例子宫内膜腺癌、1 2 例子宫内膜不典型增生及1 2 例正常子宫内膜组织中的M M P 1 2 的表达进行检测，并分析其与子宫内膜癌临床病理特征之间的关系。( 2 ) 应用蛋白质印迹( w e s t e m -
4、b l o t ) 从蛋白质水平上检测子宫内膜癌与正常子宫内膜中M M P 1 2 蛋白及其活性。应用s P s s1 0 0软件包对免疫组化结果进行# 检验。 结果M 御1 2 蛋白主要表达于子宫内膜癌细胞胞浆中，在间质中有少量表达。M M P 1 2 在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生的阳性表达率与正常子宫内膜相比有显著性差异( P 0 0 5 ) 。M M P 1 2 蛋白的表达在子宫内膜癌病理分级为G ，、G 2 中的强阳性率分别为8 0 O O 及5 7 1 4 ，均高于G 。者( 1 7 _ 3 9 ) ( P 0 0 5 ) T h es t r o n g l yp o s i
5、t i v ee x p r e s s i o np r o p o n i o n so fh 嗄M P - 12p r o t e i ni np a t h o l o g i c a lg r a d eG 3 ，G 2c a r c i n o m ac e U sw e r e8 0 0 0 a 1 1 d5 7 1 4 r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r eh i 曲e ft h a nt 1 1 0 s e i nG lo n e s( 1 7 3 0 )( P 0 0 5 ) 。二研究方法( 一) 材料1 取部分标本置于l O 福
6、尔马林中，常规石腊包埋，待免疫组化染色用。2 取部分标本离体后迅速置液氮中，然后立即置于7 0 冰箱冻存供提取蛋白质用。( 二) 方法 1 免疫组化检测M 1 2 在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达( 1 ) 主要试剂及仪器M M P 1 2 鼠抗人单克隆抗体购自R & D 公司，S P 试剂盒为北京中衫生物技术有限公司。显微镜：日本O l y m p u s ( 2 ) 具体步骤免疫组化染色：腊块标本4 啪连续切片，8 0 烤片过夜。二甲苯脱腊两次各1 5 2 0 分钟，切片经梯度酒精( 1 0 0 、9 5 、9 0 、8 0 、7 0 、5 0 、3 0 的酒
7、精) 水化，每个浓度中3 分钟。P B s 洗两次，各3 分钟。3 H 2 0 2 室温孵育5 1 0 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，然后用P B s 浸泡5 分钟。抗原修复：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在9 2 9 8 之间并保持1 0 1 5 分钟。取出容器冷却1 0 2 0 分钟，再以P B S 洗3 次，各3 分钟。加一滴正常非免疫动物血清，室温孵育1 0 分钟，倾去，勿洗，加M M P 1 2 抗体( 1 ：2 0 ，P B S 稀释) 4 过夜。P B S 洗三次，各3 分钟，加入生物素化二抗，置于室温或3 7 1 0
8、 1 5分钟，再以P B S 洗三次，各3 分钟。加链霉卵白素一辣根过氧化物酶标记的三抗，置于3 7 1 0 1 5 分钟，P B s 洗三次，各3 分钟，D A B 显色，自来水充分冲洗，进行苏木素复染，然后脱水至透明，中性树胶封片。本实验以P B S 为一抗作阴性对照，以已知阳性的胃癌切片作阳性对照。( 3 ) 结果判定以细胞内出现黄色为阳性标记，将细胞染色强度分4 级，根据细胞内黄色的深浅将不显色、淡黄色、桔黄色和棕黄色分别评为O 、1 、2 、3 分。将阳性细胞百分率分为4 级，阳性细胞百分率 3 分分别定为表达阴性、阳性、强阳性。2 w e s t e m - b l o t 方法检
9、测M M 甲1 2 在正常子宫内膜与子宫内膜样腺癌中的表达( 1 ) 主要试剂及仪器主要试剂：兔抗人M M P 1 2 多克隆抗体主要仪器：台式离心机，L D 4 2 A北京半干式多用电泳凝聚胶转移仪2 11 7 型L K B 公司7 21 可见光分光光度计上海第三分析仪器厂( 2 ) 子宫内膜蛋白质提取旧于7 0 冰箱中取出2 0 0 m g 离体标本，剪碎，加入2 0 0 山蛋白提取液( 】N P 一4 0 ，l o m MP B S ，p H7 4 ) ，冰上匀浆；将匀浆液转入一E p p e n d o r f管中，4 放置2 小时；5 0 0 0 r p m ，离心1 0 分钟；取上
10、清移至另一E p p e n d o r f 管中，测蛋白含量；分装后于2 0 储存。( 3 ) S D S P A G E 凝胶电泳配制聚丙烯酰胺凝胶：l O 分离胶，4 浓缩胶；取2 “i 样品( 含3 0 5 0 g 蛋白) ，加6 肛l 上样缓冲液，1 0 0 变性3 分钟；上样。浓缩胶 区电压1 0 0 伏，分离胶区电压1 5 0 伏。电泳后凝胶用考马斯亮蓝R 2 5 0染色2 小时，脱色液脱色。( 4 ) w b s t e m b l o t 免疫印迹分析电泳后，将S D S P A G E 凝胶放入转移缓冲液中平衡3 0 分钟；剪取同样大小的硝酸纤维素膜( N C ) 及6 块
11、滤纸，浸入转移缓冲液中平衡3 0 分钟，半干式免疫印迹法电转移到N c 膜上，电流O 8 m A ，c m 2 过夜( 1 4 1 6 小时) ，随后进行免疫酶标染色，处理如下【1 4 】：5 B S A 的 T B S ( 封闭液) 4 封闭过夜；一抗( 兔抗人脚1 2 多克隆抗体1 ：5 0 0 ，3 B s T B S 稀释) 3 7 孵育3 小时，T B S 清洗3 次，每次1 0 分钟；二抗( 冲标记的抗兔I g G1 ：】O O O ，T B S 稀释) 3 7 孵育l 小时；T B S 清洗3 次，每次1 0 分钟；加入冲反应底物肼蠕，避光处显色5 2 0分钟，蒸馏水清洗终止反应
12、。结果经0 s c a n 软件扫描定量。三统计学分析应用S P S Sl O O 软件包对免疫组化结果进行x2 检验结果1 M M P 1 2 在不同子宫内膜组织中的免疫组化表达结果M M P 1 2 主要表达于子宫内膜癌细胞胞浆中，在间质细胞中有少量表达( 见附图1 ) 。M M P 1 2 在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生、正常子宫内膜中的阳性表达率分别为7 3 8 l 、5 8 3 3 和8 3 3 。M M P 一1 2 在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生的阳性表达率与正常子宫内膜相比有显著性差异( P O 0 5 ) 。见表l表1 各种子宫内膜组织中M M P 1 2 的表达组别例数
13、阴性阳性强阳性阳性率正常子宫内膜组1 2子宫内膜不典型增生组1 2l6O18 3 365 8 3 3 +王室囱璧氇堑丝! ! !i! ：g ! !+ 与比较，P o 0 52 M M P 1 2 在子宫内膜癌组织中免疫组化表达与子宫内膜癌临床病理特征之间的关系 M 御一1 2 在子宫内膜癌细胞病理分级G 2 中的强阳性率为5 7 1 4 ，在子宫内膜癌细胞病理分级G 3 中的强阳性率为8 0 o o ，均高于G l 者的1 7 3 9 ( P O 0 5 ) ，其在子宫内膜癌各病理分级中的强阳性率之间差异显著fP 0 0 5 ) 。M M P 1 2 在子宫内膜耀不同肌层浸润深度( l 2 、
14、1 2 ) 中的强阳性率分别为4 2 8 6 、5 3 8 5 ，均高于无肌层浸润者的0 ( P 0 0 5 ) 。有盆腔淋巴结转移者M M P 1 2 表达强阳性率高于无淋巴结转移者( p 0 0 5 ) 。M M P 1 2 在子宫内膜癌手术病理分期I 期、I I 期、I I I 期中的强阳性率分别为2 4 1 4 、5 7 1 4 及8 3 3 4 ，随着子宫内膜癌手术病理分期的升高，M M P 1 2 表达强阳性率之间差异显著( P o 0 5 ) 。见表2表2M M P 一1 2 表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系病理特征例数阴性阳性强阳性强阳性率手术病理分期II II I I肌层浸
15、润无浸润 l 2l 2病理分级G lG ，G 32 97682l1 14O2 4 1 45 7 1 48 3 3 40 64 2 8 6 +5 3 8 5 +1 7 3 9 65 7 1 4 +8 0 O O + 与比较，P ( O 0 53 M M P 1 2 在正常子宫内膜与子宫内膜癌组织中的W b s t e mb l o t结果：( 见附图2 ) M M P 1 2 是5 4 K D ，M M P 1 2 蛋白的表达随着子宫内膜癌手术病理分期的升高而增强，这与免疫组化的结果相吻合。讨论恶性细胞的典型特征是具有浸润外周组织、在远处器官形成转移肿瘤的能力，肿瘤浸润和转移是导致患者死亡的主要
16、原因。目前发现肿瘤细胞与细胞外基质( E x t r a c e l lm a t r i x ，E c M ) 的相互作用在肿瘤浸润和转移中至关重要，E C M 的降解是肿瘤浸润和转移的重要途径。基底膜( B a s e m e mm e m b m c e ，B M ) 是E C M 的主要成分之一，是肿瘤细胞浸润和转移的屏障，基底膜的完整性是判定肿瘤细胞有无浸润和转移745O9748422l564OlO3620扒n为H，+如昭l5MO弱6移转移巴转移淋无转的标志。肿瘤细胞通过已存在的或新形成的结合位点与E C M 结合，溶解E C M ，最后经E C M 缺损处向外扩散。细胞外基质由型胶原、层
