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1、1绿茶提取物及表没食子儿茶素没食子酸酯对免疫细胞的作用研究作者：张凤，杨桂文，张福淼，赵静，崔英杰，安利国【摘要 】 目的研究绿茶提取物和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对脾脏细胞增殖和巨噬细胞 NO 分泌的影响。方法采用MTT 法检测脾脏细胞增殖变化，用 Griess 试剂法检测 NO 产量的变化。结果绿茶提取物和 EGCG 都能够促进脾脏细胞增殖，并能够协同 conA 刺激脾脏细胞的增殖；还能够抑制 LPS 激活的巨噬细胞RAW264.7 的 NO 产量。结论绿茶提取物和 EGCG 具有免疫调节和减轻炎症反应的有益作用。 【关键词】 绿茶 表没食子儿茶素没食子酸酯 免疫细胞Abstra
2、ct：ObjectiveTo study the effect of green tea extract and Epigallocatechin gallate（ EGCG） on spleen cell proliferation and macrophage NO production.MethodsMTT assay was used to detect spleen cell proliferation change and Griess reagent method was used to detect macrophage NO secretion. ResultsGreen t
3、ea extract and EGCG could promote spleen cell proliferation and be able to cooperate with conA 2to stimulate spleen cell proliferation.They could also inhibit LPS-activated macrophages RAW264.7 NO production.ConclusionGreen tea extract and EGCG have immunoregulative effect and can alleviate inflamma
4、tory reaction.Key words：Green tea; EGCG; Immune cells现代研究表明绿茶具有抗氧化、抗癌和防癌、降血糖、抑菌和抗病毒等生物学活性15 。在人们日益注重保健养生的今天，绿茶的系列生物学活性无疑也成为研究的热点。本实验选用山东日照绿茶为材料，用 70乙醇法抽提得到绿茶提取物，研究其对免疫细胞的作用。1 器材昆明种小鼠（山东大学实验动物中心） 。EGCG （Sigma ） ；绿茶提取物（70乙醇法抽提） ；RPMI 1640 干粉（GIBCO） ；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司） ；噻唑蓝（Sigma） ； 青霉素、链霉素（北京鼎国生物技术
5、发展中心） ；ConA（Sigma ） ；LPS（Sigma ） ；DMR 显微镜（Leica） ；MCO-17AC 二氧化碳培养箱（SANYO ；Model 550 酶标仪（BIO-RAD） 。3红细胞裂解液：NH4 Cl 8.29 g，KHCO3 1 g，EDTANa 37.2 mg。将以上试剂溶解于 800 ml 三蒸水，充分搅拌溶解混匀后，用 1N 的盐酸调 pH 值至 7.27.4 ，加水补足到 1 000 ml。过滤除菌，4保存备用。Griess 试剂：A 液：对氨基苯磺酰胺 0.5 g，10醋酸 150 ml；B 液： 萘胺 0.1 g，三蒸水 20 ml，10 醋酸 150 m
6、l，冰箱中保存，使用前 A 液 B 液等体积混合。2 方法2.1 MTT 法测定小鼠脾脏细胞的增殖取实验小鼠，脱颈处死。无菌条件下取出脾脏，剪碎，200 目尼龙网过滤。收集的细胞以无血清 RPMI1640 培养液洗涤两遍，收集后加红细胞裂解液，中止裂解后收集细胞，以无血清 RPMI1640 培养液洗涤两遍，重悬细胞于RPMI1640 培养液中。调整脾脏细胞浓度为（2106 cells / ml） ，置于 96 孔板中，绿茶提取物或 EGCG 作用 48 h 及绿茶提取物或EGCG 与 ConA（20 g/ml）共作用 48 h。实验终止前 4 h 每孔加MTT (5 mg/ml) 20 l，离
7、心，弃上清液中止反应，每孔加 150 l 二甲基亚砜，轻轻摇动 30 min 溶解紫色结晶， 490 nm 波长酶标仪比色。4SI=ConA 刺激后 A 值/ 未加刺激 A 值2.2 Griess S 法测定巨噬细胞 RAW264.7 NO 产量 NO 的定量可通过测定 NO2-和 NO3-的总和来实现，根据这一原理，应用 Griess S 试剂来定量检测 NO 水平。巨噬细胞培养上清与GriessS 试剂室温下反应 10 min，于 490 nm 处检测吸光值。3 结果3.1 MTT 法测定小鼠脾脏细胞的增殖3.1.1 绿茶提取物对小鼠脾脏细胞增殖的影响 MTT 法检测绿茶提取物对小鼠脾脏细
8、胞增殖的影响，结果表明它不仅能刺激脾脏细胞增殖，而且也能协同 ConA 刺激脾脏细胞的增殖。见图 12。3.1.2 EGCG 对小鼠脾脏细胞增殖的影响 MTT 法检测 EGCG对小鼠脾脏细胞增殖情况表明：EGCG 体外也能够刺激脾脏细胞的增殖，并协同 ConA 刺激脾脏细胞增殖。见图 34。3.2 Griess S 法测定巨噬细胞 RAW264.7 NO 产量绿茶提取物和 EGCG 都能够降低 LPS 激活巨噬细胞 RAW264.7 NO 产量，浓度越高，作用越强（见图 56 ） 。5图 1 绿茶提取物体外刺激脾脏细胞增殖（略）图 2 绿茶提取物对 ConA 刺激的脾脏细胞增殖的影响（略）图
9、3 EGCG 体外对脾脏细胞增殖的影响（略）图 4 EGCG 对 ConA 刺激的脾脏细胞增殖的影响（略）图 5 绿茶提取物对 LPS 激活巨噬细胞 RAW264.7NO 产量的影响（略）图 6 EGCG 对 LPS 激活巨噬细胞 RAW264.7 NO 产量的影响（略）4 讨论脾脏内的大量免疫细胞是其执行免疫功能的基础,其中包括巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞( dendritic cell, DC) 等。脾脏既可通过吞噬作用完成机体的非特异性免疫功能,也可以通过 T 细胞介导的细胞免疫和 B 细胞介导的体液免疫完成机体的特异性免疫功能,脾脏同时也是产生记忆性 T 细胞、B 细胞的重要场所,对
10、再次免疫应答起重要作用6 。T 淋巴细胞在非特异性物质刺激下，可被激活向6淋巴母细胞转化，在转化过程中 DNA、RNA 及蛋白质合成增加，使细胞分裂增殖。淋巴细胞的分裂增殖则是其发挥作用大小的一个衡量指标。已知 ConA 激活 T 细胞增殖时可释放 IL-2 与 IFN- 等多种淋巴因子，且 IFN- 有促肾上腺皮质激素和 -内啡肽的活性片断，均具有免疫调节作用。实验表明绿茶提取物和 EGCG 都能够刺激脾脏细胞增殖，并且能够协同 conA 促进 T 淋巴细胞的增殖。因此，它们都能促进免疫活性物质的释放，具有免疫调节作用。同时，T 细胞引起的特异性免疫应答在机体清除病原体、移植免疫和抗肿瘤免疫
11、中有重要作用。T 细胞还能够分泌淋巴因子在多个环节上参与免疫调节7，8 。综上，绿茶提取物及 EGCG 能够通过促进免疫细胞增殖和免疫活性物质的释放来发挥其免疫调节作用。巨噬细胞具有较强的吞噬能力和杀伤能力，是近年来研究比较活跃的一种重要的免疫活性细胞。它们既参与非特异性免疫这一重要的生理过程，又能够呈递抗原，产生细胞因子参与特异性免疫应答。NO 是巨噬细胞等对病原体和肿瘤细胞的细胞毒活性的效应分子，主要由活化的巨噬细胞等大量的表达一氧化氮合酶时产生。一氧化氮合酶在正常生理情况下不表达，主要在巨噬细胞、中性粒细胞和免疫细胞等受到细胞因子（如 IFN-，TNF-，Il-2，Il-1 等）及细菌脂
12、多糖（LPS）作用时被激活而产生，先表达 iNOS 的mRNA，再生成 iNOS，从而诱导产生持续时间长且大量的NO9，10 。高水平的 NO 对细胞主要发挥细胞毒作用，NO 本7身有毒性，能抑制线粒体酶，如柠檬酸合成酶、乌头酸酶等，此外NO 能与超氧阴离子（O-2）反应产生一种氧化性更强的自由基过氧亚硝酸盐（ONOO-） ，这种自由基很稳定，一旦进入靶细胞或邻近细胞将引起强烈的细胞毒性作用甚至损伤组织，因此，测定巨噬细胞产生 NO 的变化情况，对判断机体免疫状态具有重要的意义。利用内毒素 LPS 作为巨噬细胞（RAW 264.7）的 NO 合成诱导剂，加入不同浓度绿茶提取物或 EGCG，培养
13、后取上清液，测定 NO 产生量。发现绿茶提取物和 EGCG 对 LPS 诱导的 NO 合成均有明显的抑制作用，其抑制作用具有显著的量效关系。因此，绿茶提取物和 EGCG 一定意义上都能够抑制炎症介质的生成，从而减轻炎症反应。然而，这种作用是如何发挥的，是通过抑制一氧化氮合酶的产量和活性还是通过其他途径，还需要进一步实验证实。综上所述，绿茶提取物体外具有免疫调节和减轻炎症反应等有益作用，这就为开发绿茶提供了实验基础。【参考文献】1 Schut HA, Yao R. Tea as a potential chemopreventive agent in PhIP carcinogenesis: e
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16、Oh CJ, Yang ES, Shin SW, et al. Epigallocatechin gallate, a constituent of green tea, regulates high glucose-induced apoptosisJ. Arch Pharm Res，2008 ,31(1):34.6 李宗芳 ,张 澍. 脾脏的基础研究进展与展望J. 西安交通大学学报( 医学版),2008,29(1):1.97 Chen S, Chinnaswamy A, Biswas SK,et al. Cell interaction knowledgebase: an online database for innate immune cells, cytokines and chemokinesJ. In Silico Biol，2007,7(6):569.8
