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1、生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 657665 http:/657Received 2012-01-15 Accepted 2012-04-20 This work was supported by the Science Foundation for Young Talents in Universities of Anhui Province, China (No. 2012SQRL094).*Corresponding author. Tel: +86-552-3070209; E-mail: 细菌L型感染、
2、低氧诱导因子-1及MMP-9表达与卵巢上皮性 癌血管生成拟态的关系俞 岚*，武世伍，周 蕾，宋文庆蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠 233030摘 要：本文旨在探讨血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)与细菌L型(L-form)感染、低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1)及MMP-9 (matrix metalloproteinase-9)在人卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer, EOC)组织中表达的关系及功能意义。收集87例EOC术后
3、标本和20例卵巢良性上皮性肿瘤标本，应用免疫组化法、组织化学及革兰染色法检测EOC和 卵巢良性上皮性肿瘤组织中VM、HIF-1、MMP-9的表达及细菌L型的感染情况。结果显示，在EOC和卵巢良性上皮性肿瘤 组织中，HIF-1和MMP-9的阳性表达率分别为52.9%、66.7%和10.0%、10.0%；细菌L型的感染率分别为24.1%和0，差异均 有统计学意义(P 2 cm 者 31 例。有腹腔脏器及淋巴结转移者 38 例，有腹水者 21 例。年龄 1976 岁，中位年龄 50.08 岁， 50 岁 47 例，75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分 2为阴性，2 为阳性
4、。细菌 L 型感染情况，每例随机观察 10 个视野，取 L 型菌平均数，L 型菌数 30个为阳性， 0.05)。期 EOC 中 L 型的感染率为13.3% (6/45)， 期的感染率为35.7% (15/42)，两组之间差异具有统计学意义 (P 2 cm 组 )、腹腔脏器及淋巴结转移 ( 分为有转移组与无转移组 )、腹水 ( 分为有腹水组与无腹水组 )、VM ( 分为表达阳性组与阴性组 )、细菌 L 型 ( 分为感染组与未感染组 ) 以及 HIF-1、MMP-9 ( 分为表达阳性组与阴性组 ) 等因素引入 Cox 模型进行多因素分析，结果显示 ： VM、HIF-1、MMP-9 的表达以及 FI
5、GO 分期是影响 EOC 根治术后患者预后的独立因素 ( 见表 3)。 2.5 患者生存分析 本组病例患者总的 5 年生存率为 39.1%。Ka- plan-Meier 生存分析显示 VM 阳性组与阴性组 5 年图 2. HIF-1和MMP-9蛋白在EOC中的表达 Fig. 2. Expression of HIF-1 and MMP-9 protein in EOC (ElivisionTM). A: HIF-1 positive expression. B: MMP-9 positive expres- sion. C: HIF-1 negative expression. D: MMP-
6、9 negative expression. Scale bar, 100 m.图 1. EOC细胞胞质及间质内可见细菌L型圆球体及原生小体(革兰染色) Fig. 1. Bacterial L-forms were found mainly in the plasma and the stroma of EOC cells (Grams staining). A: Bacterial L-form in cell plasma of EOC (red arrow). B: Bacterial L-form in the stroma of EOC (red arrow). Scale bar,
7、 100 m.俞岚等：细菌L型感染、HIF-1及MMP-9表达与EOC血管生成拟态的关系661表1. 87例EOC组织中细菌L型感染、HIF-1和MMP-9的表达与临床病理因素的关系 Table 1. Correlation of L-form infection, HIF-1 and MMP-9 expression to clinicopathologic indexes of 87 cases of EOC Variable L-forms P HIF-1 P MMP-9 P + + + Ages 45 19 5 0.443 10 14 0.792 7 17 0.8484650 17 5
8、 12 10 7 155156 16 3 8 11 6 1357 14 8 11 11 9 13 Histological type Serous carcinoma 55 20 0.279 35 40 1.000 22 53 0.095Mucinous carcinoma 11 1 6 6 7 5 FIGO stage 39 6 0.023 36 9 0.000 26 19 0.000 27 15 5 39 3 39 Diameter of tumor 2 cm 18 13 5 26 4 27 LN metastasis Yes 26 16 0.005 5 37 0.000 4 38 0.0
9、00No 40 5 36 9 25 20 Ascite Yes 17 7 0.578 10 14 0.633 10 14 0.321No 49 14 31 32 19 44表2. EOC中细菌L型感染、VM、HIF-1和MMP-9表达各因素之间的相互关系 Table 2. The expression of VM, HIF-1, MMP-9 and L-form infection, and their relationship in EOCVariable HIF-1 r MMP-9 r Negative Positive Negative Positive L-forms Negative
10、 36 30 0.263 Positive 5 16 MMP-9 Negative 24 5 0.505 Positive 17 41 VM Negative 30 7 0.585 25 12 0.625Positive 11 39 4 46 P 0.01 or 0.05.生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 657665662生存率分别为 6.0% 和 83.8% ； L 型感染组与未感染组 5 年生存率分别为 14.3% 和 47.0% ； HIF-1 阳性组与阴性组 5 年生存率分别为 8.7% 和 73.2%
11、； MMP-9 阳性组与阴性组 5 年生存率分别为 13.8%和 86.2%，差异均有统计学意义 (P 0.05)，生存曲线见图 3。3 讨论EOC 占所有卵巢恶性肿瘤的 90% 以上，主要发生于绝经后的妇女。能否早期发现是卵巢癌治疗表3. 87例EOC患者多因素分析 Table 3. Multivariate survival analysis of 87 patients with EOCCovariate B SE Wald df P Exp(B) 95% CI FIGO 1.860 0.611 9.274 1 0.002 6.421 1.94021.249 HIF-1 0.837 0.
12、394 4.520 1 0.034 2.310 1.0685.000 MMP-9 0.749 0.353 4.510 1 0.034 2.114 1.0594.220 VM 0.965 0.436 4.899 1 0.027 2.626 1.1176.174图 3. VM、细菌L型、HIF-1以及 MMP-9表达阳性组与阴性组EOC患者生存曲线 Fig. 3. Survival curves of EOC patients with positive or negative VM (A), L-form (B), HIF-1 (C) and MMP-9 (D) expression.俞岚等：细
13、菌L型感染、HIF-1及MMP-9表达与EOC血管生成拟态的关系663成功的关键，但是卵巢癌在早期阶段由于缺乏特异性的症状而很难诊断。据估计，约有 62% 的患者就诊时已发生远处器官的转移。正因为如此，卵巢癌曾有“沉默的杀手”之称15。肿瘤 VM 是肿瘤可塑性 (plasticity) 的一种表现，是指肿瘤细胞表现出一种多潜能胚胎样的表型，肿瘤细胞获得内皮细胞特性，形成能传导血液的管腔样结构，这是一个独立于经典的血管生成 (angio- genesis) 和血管形成 (vasculogenesis) 之外的肿瘤血管形成过程。Folberg 等1在葡萄膜黑色素瘤定义了七种 VM 的形态 ： 即单
14、纯直管、平行直管 , 交叉直管、单纯不完全封闭环、具有分枝的不完全封闭环、封闭环和网络状等结构，这些结构都由肿瘤细胞互相连接，细胞外基质内衬形成，呈现 PAS 染色阳性而 CD34 染色阴性的管网结构。VM 仅出现在少数极恶性的肿瘤中，这种 VM 通路结构可给予该类肿瘤细胞充分的营养供应以满足其快速生长的需要，从而获得较高的侵袭能力和恶性度。已经有学者证实，卵巢癌就是具有 VM 结构的恶性肿瘤之一16。本研究组前期实验通过对人 EOC 石蜡包埋组织的 HE 染色切片的观察，已经发现一些类似 VM 的结构出现。为了进一步验证其真实性，我们对相同组织的连续石蜡切片进行 CD34-PAS 双重染色，
15、结果在 EOC 中检测出 VM 结构的存在，其形态有环形及网络状。这些 VM 结构无血管内皮细胞屏障，肿瘤细胞与血流之间仅有一层 PAS 阳性物质相隔，因此，具有该结构的肿瘤患者发生转移早、转移率高、临床预后差。结果同时也显示，VM 的形成与 EOC 的分化程度、临床分期以及淋巴结转移与否密切相关14。Sood 等4通过组织学与细胞学的研究证实，拟态血管生成使得卵巢癌的生物行为更趋侵袭和转移性，本结果与其具有一致性。肿瘤的发生是多因素、多阶段、长期相互作用的正常细胞恶性转化的复杂的病理过程，其本质是细胞增生与分化的调控紊乱。当细菌进入人体后，在体内溶菌酶、补体、抗体、抗生素等因素作用下，几乎不可避免地被诱导为 L 型。由于其表面结构的改变，L 型菌不易聚集，且免疫原性降低，从而可以长期存留于宿主细胞表面和细胞内。L 型菌形态多样，其中的原生小体大小类似病毒颗粒，可侵入细胞内生长，并引起病灶内巨噬细胞发生呼吸爆发和酶促化学反应，产生大量的自由基，造成组织细胞的缺氧损伤，使细胞产生小分子量的断裂因子，导致 DNA 损伤、断裂甚至错误修复，引起细胞突变或癌变17。本实验可在 EOC 细胞胞质和间质内查见细菌 L 型的存在，其感染率为 24.1%，而对照组未检出其感染 (P 0.01)。EOC 组织 期病例中，L 型的感染率为 13.3%，显著低于 期的感染率 3
