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1、陆元善, 上海交通大学附属第一人民医院检验科 上海市 200080 范建高, 方继伟, 丁晓东, 上海交通大学附属第一人民医院 消化科 上海市 200080 杨兆瑞, 上海交通大学附属第一人民医院病理科 上海市 200080 陆元善, 1998年上海医科大学硕士, 主任技师, 主要从事血脂及 其相关疾病研究. 通 陆元善, 200080, 上海市虹口区武进路85号, 交通大 学附属第一人民医院检验科. 电话: 021-63240090-4306 收稿日期: 2006-08-26日期: 2006-09-20: 2006-08-26日期: 2006-09-202006-08-26 日期: 200
2、6-09-20: 2006-09-202006-09-20Relationship between hepatic stearoyl-CoA desaturase-1 expression and adenosine triphosphate content in rats with nonalcoholic fatty liver caused by fat-rich diet Yuan-Shan Lu, Jian-Gao Fan, Ji-Wei Fang, Xiao-Dong Ding, Zhao-Rui YangYuan-Shan Lu, Department of Laboratory
3、, the First Affili- ated Peoples Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China Jian-Gao Fan, Ji-Wei Fang, Xiao-Dong Ding, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Peoples Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China Zhao-Rui Yang, Department of Pa
4、thology, the First Affili- ated Peoples Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China Correspondence to: Yuan-Shan Lu, Department of Labo- ratory, the First Affiliated Peoples Hospital of Shanghai Jiao Tong University, 85 Wujin Road, Hongkou District, Shanghai 200080, China. Rec
5、eived: 2006-08-26 Accepted: 2006-09-20 Abstract AIM: To explore the relationship between hepatic stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1) expression and adenosine triphosphate (ATP) content in nonalcoholic fatty liver caused by fat- rich diet.METHODS: A total of 30 Sprague Dawley rats were divided into gro
6、up A and B. The rats in group B were fed with fat-rich diet, consisting of 10% lard oil and 2% cholesterol, while those in group A served as controls. The rats were sacri-ficed at the 8th, 16th, and 24th week, respectively. The hepatic histological changes were evaluated by microscopy and transmissi
7、on electron mi- crocopy. The ATP contents of hepatic cell were measured by luminescent-fluorescein method. The ratio of hepatic SCD-1 mRNA to -actin mRNA was analyzed by real-time fluorescence reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). .RESULTS: The hepatocytes, stained with Hae- mato
8、xylin 16 wk: 2.26 0.55 vs 3.00 0.42, P 0.05, 2.26 0.55 vs 3.000.42, P0.05和1.740.45 vs 2.79 0.40, P0.01). 肝SCD-1 mRNA表达与ATP 含量呈正相关(r = 0.46, P0.05).结论: 长期高脂饮食引起肝SCD-1的表达下 调, 促使脂肪在肝内蓄积形成非酒精性脂肪 肝. 同时使肝细胞内饱和游离脂肪酸增加, 线 粒体结构和功能受损, 使ATP的合成和储存下 降, 加重氧化应激对肝细胞的打击和肝脏的炎 症反应.关键词 非酒精性脂肪肝; 硬脂酰CoA去饱和酶-1; 三磷酸腺苷; 实时荧
9、光RT-PCR 陆元善, 范建高, 方继伟, 丁晓东, 杨兆瑞. 非酒精性脂肪肝大鼠肝脏硬脂酰CoA去饱和酶-1表达与ATP浓度之间的关系. 世界华人消化杂志 2006;14(36):3450-3456http:/ 引言硬脂酰CoA去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD, E.C. 1.14.99.5)是单不饱和脂肪酸(monou-nsaturated fatty acid, MUFA)生物合成的限速酶,是瘦素作用目的基因之一, 在脂肪酸代谢及能量平衡中起重要的调节作用1. MUFA从其前体饱和脂肪酸经NADH依赖的黄素蛋白细胞色素b5还原酶、细胞色素b5和SCD
10、3种物质组成的酶系催化, 无氧氧化而来. SCD催化硬脂酰和软脂酰CoA形成油酰和棕榈油酰CoA. 生成的油酰和棕榈油酰CoA是细胞内合成三酰甘油、胆固醇酯和膜磷脂MUFA的主要来源2-4. 油酸是肝合成三酰甘油和胆固醇酯的必需脂肪酸, 三酰甘油和胆固醇酯是肝内装配和分泌VLDL的重要成份. 非酒精性脂肪肝主要是由于中性脂肪在肝脏中沉积所引起, 而高脂饮食是非酒精性脂肪肝形成的原因之一. 对高脂饮食引起的脂肪肝动物模型的研究发现, 非酒精性脂肪性肝脏病变大鼠血浆游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平升高5, FFA增加诱发脂凋亡, 造成肝细胞功能障碍和炎症反应. 同时, 脂
11、肪肝是能量过剩所在肝脏的表现, 对非酒精性脂肪肝患者及动物实验研究发现, 脂肪沉积的肝脏ATP储存能力下降6-7, 导致肝细胞对氧应激的反应下降, 加重FFA对肝细胞的损伤8-9. 本文旨在通过对引起FFA增加的SCD-1和肝ATP含量之间关系的研究, 给临床非酒精性脂肪肝的预防和治疗提供理论指导. 1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠, 购自于中科院上海实验动物中心斯莱克公司, 体质量150 g左右(140-160 g). 胆固醇纯品, 上海生化试剂商店. 猪油, 自备. Taq DNA聚合酶、dNTP及逆转录试剂均为Promega产品. 荧光素酶-荧光素、标准ATP粉剂和荧光素酶缓冲液均购
12、自中科院上海植物生理研究所. FG-100型发光光度计、透射电子显微镜、MJ扩增仪、低温离心机和全自动酶标仪.1.2 方法 1.2.1 非酒精性脂肪肝模型的建立 30只大鼠正常喂养1 wk后, 随机分成2组, 对照组15只, 高脂组15只. 对照组以普通饲料喂养, 高脂组以2%胆固醇、10%猪油和88%标准大鼠饲料构成的高脂饲料喂养. 于实验开始后第8, 16和24周分别处死5只对照组和5只高脂组大鼠. 大鼠以0.1 g/kg体质量氯胺酮予以麻醉, 腹主动脉采血. 称取肝湿质量后, 迅速从肝右叶固定部位切取1块肝组同行评价 本文通过对非酒 精性脂肪肝大鼠 肝脏SCD-1表达 与ATP含量之间
13、关系的研究, 为临 床非酒精性脂肪 肝的预防和治疗 提供理论指导. 实 验设计合理, 结论 可靠, 具有较高的 理论水平和临床 实用价值3452 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2006年12月28日 第14卷 第36期织, 以40 g/L的中性甲醛固定后制备成石蜡切片, 剩余肝组织经标记后投入液氮罐中冷冻保存备用, 并取2 mm3的肝脏组织投入戊二醛中固定, 送电镜检查.1.2.2 RT-PCR 从液氮中取出肝组织, 称取0.1 g, 放入Eppendorf管中, 加入1 mL TRIzol, 研磨匀浆. 匀浆中加入0.2 mL氯仿, 剧烈震荡15
14、s, 室温孵育5 min. 4, 10 000 g, 离心15 min, 将无色水相移至另一Eppendorf管. 加入0.5 mL异丙醇, 室温孵育15 min, 再4 10 000 g离心10 min, 弃上清. 沉淀加入750 mL/L乙醇1 mL, 洗涤沉淀物. 4 7500 r/min离心5 min, 弃上清. 沉淀用20 L DEPC水溶解. 取1 L溶解好的RNA溶液, DEPC水稀释至100 L, 微量分光光度计检测RNA纯度和浓度.按产品说明书操作. 取总RNA 2 g, 加入随机引物2 L, 用无RNA酶去离子水添至总体积12 L, 70, 5 min. 取出立即置冰中,
15、快速冷却. 然后加入10 mmol/L dNTP 0.8 L, 10缓冲液2 L, 25 mmol/L MgCl2 3 L, RNA酶抑制剂0.7 L和逆转录酶0.5 L, 37, 20 min, 42, 30 min, 最后95, 3 min, 4, 5 min. 产物cDNA -80保存备用.取10缓冲液2.5 L, 25 mmol/L MgCl2 3 L, 10 mmol/L dNTP 0.8 L, cDNA 2 L, 25 mol/L引物各0.5 L, Taq DNA聚合酶1 U, 20SYBR green1.25 L, 去离子水加至25 L. 按95, 3 min变性, 然后95, 20 s, 56, 30 s和72, 30 s, 40个循环. -actin的引物为: 5-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3和5-TCATGAGTAGTCTGTCAGGT-3; SCD-1的引物为: 5-TGCTGATGTGCTTCATCCTG-3和5-GGGAAACCAGGATATTCTCC-3.1.2.3 ATP测定 所有试剂均用重蒸馏水配制. 测定时, 模型組和对照组各个时期均取5个标本, 共3
