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1、浙江工商大学硕士学位论文小鼠轮廓乳头味蕾的生后早期发育及甜味（Acesulfame-k）刺 激对其影响姓名：李红涛申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：邓少平20060101小鼠轮廓乳头味蕾的生后早期发育及甜昧( A c e s u l f a m e k 1 刺激对其影响摘要味蕾是动物的外周味觉感受器，它是由味细胞和神经纤维组成的上皮特化器官，舌面上的味蕾存在于味乳头中。哺乳动物断奶时味蕾基本上己发育成熟，断奶前这段时间是味蕾发育的关键时期。在昧蕾发育过程中，神经纤维和味觉器官( 味蕾和昧乳头) 之间存在着相互依赖的关系：味觉神经对味觉器官的形成和生长有维持和提供营养的作用，而味觉器官能
2、产生神经营养素以维持神经元的正常发育。一般认为，在哺乳动物生后早期发育的过程中，环境因素( 如饮食、味觉刺激) 会影响味觉器官的发育。不过，目前有关味觉刺激对味觉器官( 味蕾) 发育是否产生影响的实验研究却一直未见报道。哺乳动物的甜昧受体主要分布在舌后部的轮廓乳头( c v ) 味蕾中。为了阐明甜味刺激对生后小鼠味蕾早期发育的影响情况，本实验对断奶前和断奶后的小鼠分别施以适当的甜味刺激，通过连续石蜡切片H E 染色及A B C 免疫组化的方法对正常组和甜昧刺激组小鼠C V乳头味蕾的分布模式( 数量、大小、形状) 及其味蛋白表达情况( 单个味蕾中g u s t d u c i n 阳性细胞的数量
3、) 进行了研究。实验动物分为三组：正常组，取材年龄为P 0 ( p o s t n a t a ld a y0 ，P 0 ) 、P 7 、P 1 4 、P 2 1 、P 3 5 、P 4 9 和P 6 3 ；P 4 刺激组，从P 4 开始每天定时段用甜味剂溶液对小鼠实施口腔甜味刺激，取材年龄为P 1 4 、lP 2 1 、P 3 5 、P 4 9 和P 6 3 ；P 2 1 刺激组，从P 2 1 ( 断奶) 开始通过饲料和饮水添加甜味剂对小鼠实施甜味刺激，取材年龄为P 3 5 、P 4 9 、P 6 3 。本实验所用的甜昧刺激物为无能量人工甜昧剂安赛蜜( A c e s u l f a m e
4、 k ) 。实验结果如下：( 1 ) 断奶前这段时间是小鼠C V 味蕾发育的关键时期，味蕾的数量和体积都处于快速增长阶段，形态变化十分明显；P 2 1 断奶时小鼠C V 味蕾在形状、大小上已趋成熟；从出生到成年，小鼠C V 味蕾的数量、具味孔味蕾的百分比以及单个味蕾中Q g u s t d u c i n 阳性细胞的数量都呈显著增加趋势。( 2 ) 从断奶前( P 4 ) 就开始接受甜味( A c e s u l f a m e k ) 刺激的小鼠到成年( P 6 3 ) 时其C V 味蕾数量显著( P 藏舌组织冲淡将4 多聚甲醛固定好的鼠舌置于流水下过夜冲洗，冲洗的舀的在予洗去组织中过剩的固
5、定液，以免沉渍于材料中影响制片和染色。( 二) 嚣舌维织黢承、透明、滏蜡为谈缀织能够完全镪埋在石蜡中，便于切成薄片，组织经嗣定永洗后，必须先让它完企脱去水分。脱水的方法，一般是将组织经过各级浓度的酒精，逐步将缝织内部豹承努镪底蛰羧友去，鞋秘予绥织酶透爨、浸蠖。因戴瓣求是割片邈爨的一个羹蒙环节。大多数脱水剂不能和石蜡相混含，因此需要邂明剂作为脱水剂和石蜡的媒费。透明舞毒取代乙酸载终曩，又鸯滚瓣五蟮的功散，缝织经_ 邈这一处理，馒予石蜡渗入缀织内部，有制于包埋和切片。二甲苯怒使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强、溶解石蜡量大、易挥发的优点，适合于一般组织的透明。但是二甲苯容荔旋缀织强烈敬缝、交硬
6、帮交藤，嚣魏透明时越不麓太妖。浸蜡怒为了逐步除去组织中的遴明剂二甲苯。浙江工商大学硕士学位论文脱水、透明、浸蜡的操作流程如下： 30乙醇4“C5 h 50乙醇4“C4 h 70乙醇4。C过夜8 0 乙醇4 3 h 90乙醇4。C2 h9 5 乙醇I4 2 h9 5 乙醇I I4 。Cl h1 0 0 乙醇14 “ Cl h ( 浸入前用滤纸吸干水分)1 0 0 乙醇l I4 。Cl h二甲苯：乙醇( 1 ：1 ) 4 。C2 0 m i n 二甲苯4。C2 0 m i n二甲苯：乙醇( 1 ：1 )6 0 2 0 m i n石蜡l6 0 6 5 l h石蜡l I6 0 6 5 l h石蜡I I
7、 l6 0 6 59 C2 0 m i n脱水、透明在冰箱中进行，浸蜡过程在烘箱中。( 三) 石蜡包埋包埋时在包埋盒内壁涂上一薄层甘油，然后倒入熔化的石蜡，用镊子在酒精灯上稍加热，轻轻将鼠舌组织块包埋盒内，每盒平行以一定间距放置3 个鼠舌，将要切的面( 舌背) 朝下摆正位置，将舌的后端靠近包埋盒壁以便切片时从舌后切起。( 四) 切片、贴片切片前需修整好蜡块。修蜡时，一定要使蜡块的上下边线平行。组织四周应留有】2 m m 宽的石蜡，否则不易切片和展片。用于H E 染色的切片厚度为1 0 1 a m ，A B C 法免疫组化的切片厚度为7 , u m 。切片时，左手可持毛笔，右手转动切片机进行切片
8、。切出的蜡片形成蜡带，左手用毛笔托住蜡带，右手不断摇动切片机，便可得到连续切片。蜡带背面比较亮、光滑，正面较为暗、粗，因此贴片时应将背面与载玻片接浙江工商大学硕士学位论文皴，这糕翳予震孚稠戆紧。然后终带毒嫩片懿玻片敷在震冀台上，瓣片困受热藤伸展。待切片干后i 再饕3 74 C 温箱内烘干( 约1 2 小时) ，然后染饿。切片4 可长期保存。切片爨燕验器匿及瓣次方法：( 1 ) 切片弯曲：蜡块上下不平，修切蜡块使上下平行；( 2 ) 切片不成带：奎温过低或蜡太硬，可在切片机旁加台灯提高环境温度；( 3 ) 戆片皱缭、，不平：耩太软，蹇湛蓬裹，蠲球决臻一下器秘；( 4 ) 切片上组织与蜡分离：浸蜡
9、不足，重新、漫蟾、包埋。八、祗蜡切片H E 染色( 一 裁蟮、染色、封菏组织学中最常用的是苏木精( h e m a t o x y l i n ) 和伊红( e o s i n ) 染色法，简称H E 染色法。它使细胞核和细胞质分别染成不同的蘸、红两种颜色，称为对比絷色。一簸认为细瞧菝( 染色蒺) 是酸瞧豹，它薤染上碱经染辩( 鲡芬本精) 两鍪蓝色；而细胞质是碱性的，它可染上酸性染料( 如伊红) 而呈红色。配好苏本精染液是H E 染色的关键，本实验选用的E h r l i c h s 熬本糖染液。在染色程痔中，E h r t i c h s 棼本精染色5 2 0 m i n ，0 2 5 伊红
10、一滔精聚色1 0 r - 2 0 s ，染色的时f I J 随试验动物的年龄而有所不同。苏本精染色后需将切片浸予O 1 为蕊酸一乙醇溶液中进行分霞。分色是把过染的细魏辕帮分和不瘟着絷苏本精的纲胞浆等组织畿分靛色，飘张谈羞染豹缨灏核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分色时间的长短视缀织的性质，切片的厚薄，苏木糖染色鲍深浅和分色液的新l E 柬决定，一般是2 5s 。若切片不分色或分魏不足，组织不仅着染细胞梭，氇着染细臌浆等其谴成分，经组织结淘对比不清晰；若分色过魔，细胞核过淡或褪色。靛酸乙醇分色厢，一般需流水冲冼，避免切片整有盐酸锼细胞核褪彀，同时苏本耪经酸压要经流水冲洗来促蘸，流承冲凌般需
11、1 5 3 0m i n 。进行脱蜡、染色的流程如下( 室温) ；二甲苯l ( 脱蟮)5 r a i n二单苯1 12 r a i n二甲笨：乙醇( 1 ：1 )2 m i n浙江工商大学硕士学位论文1 0 0 乙醇2 m i n9 5 乙醇2 m i n8 0 乙醇2 m i n 7 0 乙醇l m i n 5 0 乙醇l m i n3 0 乙醇1 r a i n蒸馏水2 m i n苏木精染色5 2 0 m i n自来水冲洗无紫色液下流为止0 1 为盐酸一乙醇分色2 5 s自来水冲冼1 5 3 0m i n 。7 0 乙醇I m i n8 0 乙醇1 m i n9 0 乙醇1 m i n0
12、2 5 伊红染色1 0 2 0 s9 5 乙醇Il m i n9 5 乙醇1 t2 m i n1 0 0 乙醇Il m i n1 0 0 乙醇1 12 r a i n二甲苯：乙醇( 】：1 ) l m i n二甲苯I2 m i n二甲苯】l2 m i n中性树胶封片( 注意防止有气泡产生)( 二) 轮廓乳头味蕾计数味蕾计数方法参考H a r a d a 等5 7 1 ，在光学显微镜下直接观察连续切片完成计数工作。轮廓乳头的每张切片上往往存在多个味蕾，单个味蕾可以分稚在多张连续的切片上，在显微镜下通过观察相邻数张切片上味蕾的位置和形态可以判断在不同切片上的味蕾是否是同一个，从而可以确定整个乳头中
13、味蕾的个数。对鼠舌轮廓乳头( 图2 2 ) 进行冠状切片的结果使得每张切片上都有两个轮廓乳头“沟”，浙江工商大学硕士学忙论文每个“沟壁”一般上都有味蕾存在，计数时为了方便，每次先计数一个“沟壁”的味蕾，四个“沟壁”观察完后就能计数出整个乳头味莆的数目( 图2 - 3 ，2 4 ) 。圈2 - 2 P 4 9 小鼠轮廓乳头外观n g 2 2T h ea p p e a r a n c eo f C Vp a p i l l af r o maP 4 9m o l l i e( 三) 轮廓乳头味蕾高、宽和面积的测量味蕾测量方法参考H a r a d a 等1 5 7 。味蕾长、宽和面积( 经过味蕾
14、顶端的最大截而积) 的测量是仵其冠微图像上进行的( 图2 - 5 ) 。本实验应用S C O P E T E K 电予显微目镜( D C M l 3 0U S B l 0 ，杭州敏朗光电技术有限公司) 进行屁微图像的拍摄( 用于味蕾测量的图像均在显微镜4 0 X 物镜下拍摄) 。然后，将所得数码图片( 1 2 8 0 1 0 0 8p i x e l s ，2 4 b i t s p i x e lc o l o r ) 存入电脑，亓应用电子l 二1 镜再已套分析软件S c o p e P h o t o I 0 对味味蕾长、宽和最大纵截血哑积进行测量。图2 3P 4 9 小鼠轮廓乳头切片F
15、i g 2 - 3As e c t i o no f C Vp a p i l l a ef r o maP 4 9m o u s e浙江= ：= 商大学硕士学位论文图2 _ 4 四张P 4 9 小鼠轮廓乳头连续切片F i g 2 - 4F o u rs e r i a ls e c t i o n sf r o mo n eg r o o v eo f aC Vp a p i l l a eo f aP 4 9m o u s e注：图中的连续切片上有8 个不同的味蕾，箭头所指处为味孔图2 5P 4 9 小鼠轮廓乳头味蕾切片F i g2 - 5As e c t i o no f C Vt a
16、s t eb u d sf r o maP 4 9m o u s e注：图中有2 个味蕾，箭头所指处为昧孔：多边形用面积即为该味蕾的最大纵截面面积；两条相互垂直的线段中较长的( 经过昧孔，箭头所指) 表示味蕾的高，短的表示味蕾的宽。九、石蜡切片A B C 法免疫组化( 一) 免疫组化染色方法A B C 法免疫组化染色流程如下( 阴性对照省略一抗) ：( 1 ) 石蜡切片脱腊至水二甲苯I ( 脱蜡)5 m i n二甲苯I I2 m i n二甲苯：乙醇( 1 ：1 )2 m i n浙江工商大学硕士学位论文1 0 0 乙醇2 m i n9 5 乙醇2 m i n8 0 乙醇2 m i n70乙醇lmin 5 0 乙醇l m i n3 0 乙醇I m i n蒸馏水2 m i n( 2 ) 微波法抗原修复在微波炉里用中高火加热0 0 1 M 枸橼酸钠缓冲溶液( p H 6 O ) 至沸腾，将切片插入塑料架上，放入沸
