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1、羧基肽酶 A催化机理的结构基础羧基肽酶A，是一个由307 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，他紧密结合着一个锌离子，这个锌离子是酶活性必须的。羧基肽酶A 最容易水解底物分子中C-末端具有芳香和大的脂肪侧链的肽键，它催化除了碱性氨基酸和脯氨酸为羧基端氨基酸的的C-末端肽键。 1967 年人们获得了0.2nm 分辨率的羧基肽酶 A 的三级结构，发现了羧基肽酶A 分子中紧密地结合着一个锌离子，这个锌离子对酶的催化作用有着关键的作用。这个锌离子位于接近分子表面的沟槽中，他以配位键与成四面体排列的两个组氨酸（His60、His196） ，一个谷氨酸（Glu72） ，和一个水分子相连，靠近锌离子有一个裂缝，
2、允许底物末端的侧链伸进来。他的活性部位就是由两个组氨酸（His 196和 His69）以及一个谷氨酸（Glu 72）构成的。羧基肽酶A 是一个外肽酶，它催化肽链C-末端的肽键水解，为了研究清楚这个酶的作用历程， 人们曾经设计过一个很差的底物，叫 “钝化底物” ， 这个底物就是甘氨酰酪氨酸（Gly-Tyr） 。在这个酶的催化反应中，酶跟底物结合的时候，底物便进入酶分子表面的“裂缝”当中，并且诱导酶活性部位的构象发生巨大的变化，酶活性中心功能基团，包括Tyr248、Arg145、Glu270 和锌离子形成正确的催化部位，将底物分子定位在酶活性中心。底物分子的羧基上的氧负离子和Arg 残基的氨基侧链
3、会有氢键相互作用。羧基肽酶A 的催化机理，主要认为有两个因素在起作用：第一，在底物的诱导下，酶活性中心的结构发生了巨大的变化，Arg145 的胍基和Glu270 的羧基都移动了0.2nm，Tyr248 的酚羟基移动了1.2nm。底物的靠近和定向效应十分显著。二，酶的Glu270 使得底物敏感键发生了电子张力，结果敏感肽键变得很容易断裂。羧基肽酶 A 的催化历程：1.底物的结合：底物羧基端羧基上的负电荷与酶的活性中心Arg145 残基的正电荷相互吸 引，促进底物和酶的活性中心的结合。底物肽链 C-末端的芳香族或者较大的非极性侧链伸进非极性的口袋。这里的较大的疏水侧链会产生疏水相互作用，稳定芳香族
4、和疏水侧链的与口袋内部的基团的结合。2.酶分子中Tyr248 的酚羟基上的H 与底物中敏感肽键的亚氨基上的N 形成氢键。这个氢键的形成对后面羰基氧和锌离子配位体的形成很重要。3.底物敏感键上的羰基氧取代了与锌离子配位的水分子，羰基氧和锌离子配位。形成了配 位体，使得电子进一步离域化，方便电子和亲电试剂发生各种反应。这就是底物和酶形成的一个反应性很高的，容易变成过渡态的共价中间物，可以使得反应的活化能大大降低，底物可以越过能垒而迅速生成产物，这种催化方式可以称为共价催化。4.因为底物敏感键的羰基和锌离子配位，受到锌离子的吸电子作用，使得底物的羰基碳原子在亲核进攻面前更加脆弱，Glu270 的羧基
5、本身作为亲核试剂或者通过激活水分子而以水分子作为亲核试剂进攻敏感键的羰基碳原子。与此同时，Tyr248 向该肽键的亚氨基提供一个质子，最后肽键断开，生成第一个产物，胺。5.酶的复原： Glu270 上的羧基作为亲核基团和底物羰基共价结合，形成酐。最后，水分子使得酐水解，生成另一个产物，酸，酶恢复原状，完成了一个反应的循环。这个酶的酶促反应属于乒乓反应机理，但是也有一种观点认为，这个酶的反应机理是属于有序双双反应，在这个反应下，酶分子的Glu270 先激活水分子，用水分子中的OH-来直接进攻敏感肽键的羰基，与此同时，Tyr248 提供一个质子， 肽键直接水解，不经过形成酸酐的中间步骤，酶的Glu
6、270 在离解之后恢复原状，同时Tyr248 从溶液环境接受一个质子，恢复原状。我们再审视一下这种共价催化机制，这种共价催化的限速步骤可能是共价键的形成步骤，反应速度随着共价催化剂的碱性增加而增加。如果形成共价键越稳定，那么共价键的分解就越困难。一种好的共价催化剂必须同时具有似乎矛盾的两种特质，高的亲核性并且使得形成的化学键容易断裂，具有高极化性的亲核基团是良好的共价催化剂。Christianson D W, Lipscomb W N. Carboxypeptidase aJ. Accounts of Chemical Research, 1989, 22(2): 62-69. Larsen
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