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1、作者单位:100039 北京,解放军第三 二医院临检中心技术方法乙肝患者外膜蛋白血清学检测及对于判定 HBV DNA复制的意义毛远丽 李伯安 马洪滨 孙志强 史佳彬 李筱涵 徐军 王雪飞 杨丽华【摘要】 目的 探讨HBV感染者血清中PreSl2Ag、PreS22Ag、 大蛋白(LP)的检测意义及其对判定HBV复制的意义。方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测201例HBV感染血清的PreS12Ag、PreS22Ag、HBV2LP及HBV M,同时应用荧光定量PCR方法检测HBV DNA。结果 PreS12Ag、PreS22Ag、LP、HBsAg阳性率差异有统计学意义,PreS22Ag、L
2、P检出阳性率均高于HBeAg;LP的检出阳性率与HBVDNA的检出阳性率相关性有统计学意义,且HBV DNA拷贝数的对数值与HBV2LP表达呈正相关。结论 PreS12Ag、PreS22Ag、LP较准确的反映乙肝病毒的复制情况,是HBV M有益的必要补充;血清中HBV2LP的含量与HBV DNA的拷贝数具有较好的相关性。【主题词】 肝炎,乙型; 肝炎病毒,乙型; 肝炎抗原,乙型; 病毒包膜蛋白; 遗传标记Significance of hepatitis B virus PreS12Ag, PreS22Ag, large protein , PreS22Ab detection and the
3、 prediction of HBV DNA replication MAO Yuan2li,LI Bo2an,MA Hong2bin,SUN Zhi2qiang,SHI Jia2bin,LI Xiao2 han,XU Jun,WANG Xue2fei,YANG Li2hua.Center of Clinical Laboratory,The No. 302Hospital of The Peoples Liberation Army,Beijing100039 , China【Abstract】 Objective T o explore the significance of hepati
4、tis B virus PreS12Ag , PreS22Ag , large protein (LP) detection and the prediction of viral replication. Methods PreS12Ag , PreS22Ag , LP ,and HBV markers were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in 201 cases of infected serum. Serum HBV DNA level was quantitatively detected by real
5、2time polymerase chain reaction (PCR) . Results There were significant differences in positive rate between the PreS12Ag ,PreS22Ag , LP , and HBsAg; the positive rate of PreS22Ag and LP were higher than that of the HBeAg. No significant differences were found in the positive rates between LP and the
6、 levels of HBV DNA and there was a positive correlation between quantitations of HBV DNA and HBV2LP. Conclusion Serum PreS12Ag , PreS22Ag and LP were laboratory markers that can accurately reflect HBV DNA reproduction , and were helpful complementarity to traditional HBV M. There is a close correlat
7、ion between the number of copies of HBV DNA and the levels of HBV2LP. 【Key words】 Hepatitis B; Hepatitis B virus; Hepatitis B , antigens; Viral envelope proteins; Genetic marks乙型肝炎是影响人类健康的主要传染病之一, 其不仅感染率高,而且易于慢性化,引起肝硬化和原 发性肝癌。HBV为嗜肝DNA病毒,含有3200个核苷酸,含有4个开放读码框架,编码6种蛋白,其中S 基因编码3种外膜蛋白,包括主蛋白(即HBsAg) ,中 蛋
8、白(即HBsAg和Pre2S2蛋白)和大蛋白(即HBsAg、Pre2S1蛋白和Pre2S2蛋白)1。近年来随着对HBV 外膜蛋白在乙型肝炎发病机制、 感染与病毒复制等方面研究的深入,研究者们逐渐认识到了其具有越 来越重要的临床意义,如Pre2S1抗原能够反映HBV的复制情况,可以作为预测干扰素治疗是否有效的 指标,推测急、 慢性乙型肝炎的预后情况,并可用于 制备重组乙肝疫苗等2。目前临床上习惯以HBeAg来判断乙肝病毒复制及传染性强弱。但是当乙肝病 毒发生前C与C区变异后,会出现HBeAg阴性,而 病毒仍复制的情况,造成临床难以确定停药时机及 治疗结束后应答持续时间短等情况的出现3。为探 讨乙
9、肝患者血清中HBV PreS12Ag、PreS22Ag、PreS22Ab及LP检测的临床指导意义及其与HBV DNA水 平的关系,本研究对201例慢性乙型病毒性肝炎患 者的HBV DNA、HBV M、PreS12Ag、PreS22Ag、PreS22Ab 及LP进行了检测分析。672中华实验和临床病毒学杂志2006年9月第20卷第3期 Chinese J Exp Clin Virol ,September 2006 ,Vol 20 ,No131 材料和方法111 材料 随机选取解放军第三 二医院2002年6月至2006年3月乙肝患者血清201份,标本均于- 80保存。HBV Pre2S1抗原检测
10、、HBV Pre2S2抗原检测、HBV DNA实时荧光聚合酶链反应(PCR)定量检测及HBV M检测试剂盒分别购自上海阿尔法生物技术有限公司、 北京肝炎试剂研制中心、 达安基因公司和北京科卫试剂公司,检测HBV2LP的单克隆抗体由热景生物技术有限公司馈赠。112 方法11211 HBV Pre2S1 Ag、Pre2S2 Ag、HBV DNA、HBV M及HBV2LP的检测:均严格按试剂盒操作说明进行。11212 统计学方法:采用SPSS 1310软件进行统计学分析。各种检测指标阳性率的比较均采用2检验,HBV2LP含量与HBV DNA的拷贝数的相关性分析采用频数表的相关与回归分析。2 结 果2
11、11 PreS12Ag、PreS22Ag、LP、HBsAg阳性率比较 血清检测结果见表1。统计分析表明4种外膜蛋白检出阳性率差异有统计学意义(2= 72157 ,P=0100 0101) ,同时LP与HBsAg检出阳性率差异也无统计学意义(2= 4189 ,P= 0103 0101)。表1 血清PreS12Ag、PreS22Ag、LP、HBsAg、HBeAg检测结果Tab11 Detection of serum PreS12Ag , PreS22Ag , LP and HBsAg项目 Item阳性数 No1Positive阴性数 No1Negative阳性率( %) Positive rat
12、e ( %)PreS12Ag1317065117PreS22Ag1495274113LP1792289105HBsAg1911095102HBeAg1168557171212 PreS12Ag、PreS22Ag、LP、HBeAg阳性率比较 统计分析表明PreS12Ag、PreS22Ag、LP、HBeAg检出阳性率差异有统计学意义(2= 53180 ,P= 0100 0101) ,但PreS22Ag、LP检出阳性率均高于HBeAg(2= 12118 ,P= 0100 0101)。表2 前S1、 前S2、 大蛋白阳性率与HBV DNA阳性率的比较Tab12 The relationship bet
13、ween PreS12Ag , PreS22Ag ,LP and HBV DNAHBV DNAPreS12AgPreS22AgHBV2LP+-+-+-总计 T otal+128601454317315188 310496713 合计T otal131701495217922201214 HBV2LP与HBV DNA的相关性 HBV DNA拷贝数的对数值与HBV2LP定量值的相关系数r=01902 ,回归方程为Y= 11604 + 01501X(P 0105) , 这一结果说明HBV DNA拷贝数的对数值与HBV2LP 定量值具有正相关关系, HBV DNA拷贝数的对数值变化可以用HBV2LP定
14、量值为解释变量的线性回归模型来推导。3 讨 论乙肝病毒感染人体后,在血清中存在形式主要有三种,即大球形颗粒(Dane颗粒)、 小球形颗粒和管形颗粒。前S1抗原、 前S2抗原只在Dane颗粒上 表达,前S1抗原由108110个氨基酸残基组成,其2147位氨基酸为肝细胞膜受体。前S2抗原含有55个氨基酸残基,其C端与表面抗原N端相连,其N端109133位氨基酸为聚合人血清蛋白受体4。 因此,二者可作为乙肝病毒感染复制的指标。但通过研究鸭乙肝病毒发现,含有嗜肝病毒血清的感染 性不仅依赖于具有感染性Dane氏颗粒的多少,而且 还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗粒(SVPs , subviralparticle
15、s ,包括管状颗粒和小球颗粒)的数量,该亚病 毒颗粒在HBV感染过程中,能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达,而这种增强作用是由pre2S蛋白的反式激活作用所触发的5。还有研究发现,在HBV形成包膜的过程中需要大蛋白(即HBsAg、Pre2S1蛋白和Pre2S2蛋白)和中蛋白(即HBsAg和Pre2S2蛋白)的参与6 , 7,因此除了检测HBsAg外,Pre2S蛋 白的存在对于临床判定HBV复制具有一定意义。772中华实验和临床病毒学杂志2006年9月第20卷第3期 Chinese J Exp Clin Virol ,September 2006 ,Vol 20 ,No13本研究对目前较常用的
16、HBV外膜前蛋白检测 指标(包括Pre2S1、Pre2S2及大蛋白)进行了相关性研究,同时比较了它们与HBV M的关系及其在判定HBV DNA复制中意义。结果显示,在外膜蛋白中HBsAg与LP的阳性率高于Pre2S1蛋白和Pre2S2蛋 白,同时Pre2S1蛋白和Pre2S2蛋白阳性率差异无统 计学意义。这一结果表明单独的PreS1或PreS2蛋白的检测仅能部分反应HBV外膜蛋白在血清中的 表达状态。其原因可能与试剂盒包被单抗针对抗原 表位有关,Pre2S1、Pre2S2蛋白检测试剂盒仅仅针对 线性表位,但是编码Pre2S蛋白的LP Pre2S区具有较 为复杂的拓扑结构6,便可能是导致Pre2S1及Pre2S2抗原的检出率低于LP的原因。进一步研究表明PreS12Ag与HBeAg检测的阳性率差异无统计学意义 而PreS22Ag、LP检出阳性率均高于HBeAg ,提示外膜 蛋白是对HBeAg检测的有益的补充
