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1、蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品） 、储品规（放置消毒过的物品） 、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品） 、（测量培养用液 ） 、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液） 。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物） 、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ 、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录） 。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞） 、超净工作台、倒置显微镜、育培养物） 、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置 培养用液） 。周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3氧乙酸擦拭。养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用7
2、5氧乙酸，开紫外灯、三氧杀菌机、75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：好隔离帽、口罩、精棉球擦净双手。无菌操作的演示：养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。止交叉污染。1)新的玻璃器皿的洗消：去灰尘。盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200馏水 1000泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏
3、水冲洗3装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20)旧的玻璃器皿的洗消：1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。洗：烘干后泡入清洁液（酸液） ，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗） ，再用蒸馏水冲洗3次。装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的
4、上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用 6时,或者煮沸20
5、分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟） ，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6记时间不能过长） ，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。4. 胶头可用75酒精
6、浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。养板，冻存管：的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000100000 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(g，30盐酸10馏水88意事项：压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干
7、，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。. 泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。腐蚀地面。C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、磁力搅拌器。具体步骤：(1)水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.(2)制备与消毒 (也可用于其它 ：的配制)：药品（2O . 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至100
8、0匀即成新配制的 液。 入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 ：。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双
9、蒸水（若用双蒸水需要调 中。搅拌混匀，置于4 内过夜。好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（滤除菌。然后分装成小瓶于保存以备使用。(4)青、链霉素溶液的配制于消毒1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。霉素是80万单位/瓶，用注射器加4菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。青链霉素的浓度最终为100单位/单位1微克？(5) 、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/后用一个当量的盐酸和 后定容至1000匀。装时先装好支架，按规定
10、放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。养液中加入1氨酰胺溶液（4时两周有效） 。血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。(7)液：化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N 。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 围。使用终浓度为 10，一般培养液内含20可达到缓冲能力。1 冲液配制方法如下：准确称取 入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4保存。注意：因为现在
11、市售 约10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 终浓度仍然为20m 。如：于20蒸水中，过滤除菌后可完全（20入1L 培养液中，或者每100养液中加入2可。谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存 2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14 。可以配制200 谷氨酰胺
12、液贮存，用时加入培养液。配制方法为，于三蒸水加至100配成200 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，保存，使用时可向100养液中加入1氨酰胺溶液。(9)有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/为现在市售的多为肝素钠，配制时，可将其溶于100蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 。使用时，向100养液中加入1可。(10) 型胶原酶：型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10瓶保存。(11)为明胶难于过滤，胶溶液必须用无菌的 制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。成100液）即解决无菌分装药品的问题。
