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1、细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(2):http:/www.cjcb.org小鼠胚胎干细胞的培养饲养层的制备完全培养液: 90% 高糖 DMEM (Gibco 12430);10% FBS (Biochrom S0615)冻存液: 90% 完全培养液; 10% DMSO (SigmaD2650) 取得小鼠胚胎:1性成熟雌小鼠与种雄鼠按 21 比例合笼。2每天早上观察雌小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的 0.5 d。3取怀孕 12.515.5 d 的雌鼠, 断颈处死, 无 菌条件下暴露
2、子宫。4用眼科镊提起近子宫颈端, 分离子宫系膜,剪断子宫角。5取出整个子宫, 置于有 PBS (Invitrogen14190)的平皿内。用 PBS 洗涤 3 次, 弃除表面残余血迹。 6沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎, 置于另一盛有 PBS 的平皿内, 充分洗涤, 弃除表面红细胞。7用眼科镊撕破胎膜, 取出胎鼠,弃除胎膜。8 去掉胚胎头部和内脏, 将躯干部分置于另一盛有 PBS 的平皿内, 用 PBS 洗涤两次, 充分弃除红 细胞。要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源
3、的成纤维细胞。取得小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF):1用无菌眼科剪将鼠胚躯干剪成 1 mm3以下的碎块, 吸置于离心管内。2加适量 0.25% Trypsin-EDTA (Invitrogen,25200), 将离心管置于培养箱中温育 20 min。3取出离心管, 反复吹打 2030 次, 加足量培 养液终止消化。4分装到 T75 培养瓶中, 一般每 1 个胚胎可以特约综述特约综述专题介绍专题介绍制成 12 个 T75 培养瓶的原代细胞。5置 37 、5% CO2、饱和湿度培养箱培养。6第二天换液, 去掉含有胰蛋白酶和较多死细胞的培养液。 7
4、待细胞长 37 d, 细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可 1316 传代, 此传代后的细胞记为第一代。要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。MEF的传代方法: 1吸弃培养液上清液。2PBS 冲洗两次。3吸去 PBS, 加 0.25% Trypsin-EDTA 消化。在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时, 用移液管吹打冲洗瓶底 56 次。4即刻加 MEF 培养液终止消化。 5细胞悬液转移到离心管中, 1 000 r/min, 5min 离心。吸弃上清液。6加足培养液, 吹打制成单细胞悬液, 分装到各 T75 培养瓶中。完成传
5、代。7原代细胞中还有少量组织块未被充分消化,在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液, 组 织块会逐渐消失。要点: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液, 随着培养时间增长和传代次数的增加, 细胞增殖速度减慢, 35 代的成纤维细胞都可用作培养小鼠胚胎干细胞的饲养层。丝裂霉素 C (mitomycin C)处理 MEF: 1取新的培养瓶, 加 0.1% Gelatin (SigmaG2500)溶液覆盖预处理 30 min, 用前吸掉 Gelatin溶液。2取需要处理的 MEF 细胞, Mitomycin-C(Sigma M0503)以 10 g/ml 工作浓度加在 MEF 培养液里
6、, 混匀。 3置培养箱中作用 3 h。4吸弃废液。细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(2):http:/www.cjcb.org5用 PBS 洗 5 遍。6加 0.25% Trypsin-EDTA 消化。在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时,用移液管吹打冲洗瓶底 56 次。7即刻加适量 MEF 完全培养液终止消化。 8细胞悬液转移到离心管中, 离心1 000 r/min,5 min。吸弃上清液。9处理过的MEF细胞加适量培养液重悬计数,以3.0104个/cm2 (MEF)密度均匀地铺在Gelatin处理过的培养瓶上。10置培养箱中静置过夜, 使其贴壁。11铺好的饲养层在 17 d 内都可以较好地支持小鼠胚胎干细胞的生长并维持其全能性要点: 注意丝裂霉素 C 的有效期和使用方法。购买的粉剂丝裂霉素C, 用之前应以适量PBS彻底融解, 0.22 m滤膜过滤除菌, 分装后存放于 4 。若 发现分装的丝裂霉素 C溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素 C已经失效, 不能再使用。中科院上海生命科学研究院生化细胞所干细胞技术平台徐 兰 刘敏英
