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1、（九）离子对色谱法（MPIC）（九）离子对色谱法（MPIC） Ion pair chromatography1. 原理：主要是基于待测组分在分析柱上的吸1. 原理：主要是基于待测组分在分析柱上的吸 附作用不同而进行分离的。附作用不同而进行分离的。固定相固定相：疏水性的苯乙烯疏水性的苯乙烯/二乙烯苯树脂或键合的 硅胶。 流动相：水离子对试剂有机溶剂 离子对试剂：所带电荷与待测离子相反。二乙烯苯树脂或键合的 硅胶。 流动相：水离子对试剂有机溶剂 离子对试剂：所带电荷与待测离子相反。分析柱的选择性：主要由流动相决定。改变 离子对试剂和有机溶剂的类型及浓度，可改变分 离的选择性。分析柱的选择性：主要由
2、流动相决定。改变 离子对试剂和有机溶剂的类型及浓度，可改变分 离的选择性。机理，有三种模式：机理，有三种模式：（1）离子对形成：待测离子与）离子对形成：待测离子与“离子对试剂离子对试剂”，形 成中 性的，形 成中 性的“离子对离子对”化合物，利用它在流动相和 固定相之间的分配系数不同进行分离。 例如：以非极性键合相为固定相，于流动相中加 入离子对试剂化合物，利用它在流动相和 固定相之间的分配系数不同进行分离。 例如：以非极性键合相为固定相，于流动相中加 入离子对试剂B+，来分离一组阴离子：来分离一组阴离子： +有机相水相水相BABAA 待测离待测离由于离子对由于离子对AB具有疏水性，可被非极性
3、固定相提取。其它待测离子具有疏水性，可被非极性 固定相提取。其它待测离子A1，A2， A3.因与因与B离子间的成对能力不同，而 形成不同疏水性的离子对，它们在柱内的 保留值不同，从而达到各组分离子相互分 离的目的。离子间的成对能力不同，而 形成不同疏水性的离子对，它们在柱内的 保留值不同，从而达到各组分离子相互分 离的目的。（2）动态离子交换（2）动态离子交换 认为离子对试剂的疏水部分，吸附到固定相并认为离子对试剂的疏水部分，吸附到固定相并 形成动态的离子交换表面，待测离子被保留在形成动态的离子交换表面，待测离子被保留在 这个动态的离子交换表面上。这个动态的离子交换表面上。（3）离子相互作用：
4、3）离子相互作用：2离子对试剂的选择2离子对试剂的选择（1）分离亲水性离子）分离亲水性离子选用疏水性离子对选用疏水性离子对 试剂。试剂。 分离疏水性离子分离疏水性离子选用亲水性离子对试剂。选用亲水性离子对试剂。 （2）相对分子量较小的离子对试剂比分子量大）相对分子量较小的离子对试剂比分子量大 的分离效果更好。的分离效果更好。 离子对试剂的浓度：一般离子对试剂的浓度：一般5104101mol.L-1 浓度越大，被分离物的保留值也越大。浓度越大，被分离物的保留值也越大。表表3常用的离子对试剂常用的离子对试剂疏水性疏水性增加增加 ZZZENGJIA 阴离子分离阴离子分离阳离子分离阳离子分离氢氧化铵
5、氢氧化四甲基铵（氢氧化铵 氢氧化四甲基铵（ TMAOH） 氢氧化四乙基铵（） 氢氧化四乙基铵（ TEAOH） 氢氧化四丙基铵（） 氢氧化四丙基铵（ TPAOH） 氢氧化四丁基铵（） 氢氧化四丁基铵（ TBAOH）HCI HCIO4 全氟羧酸 戊烷磺酸 己烷磺酸 庚烷磺酸 辛烷磺酸全氟羧酸 戊烷磺酸 己烷磺酸 庚烷磺酸 辛烷磺酸疏水性增加疏水性增加常用的有机改性剂：常用的有机改性剂：乙睛，甲醇，异丙醇思考：思考：在在 pH值值7时，分离一组羧酸，若用离 子对色谱法分离，应如何选择离子对试剂？时，分离一组羧酸，若用离 子对色谱法分离，应如何选择离子对试剂？3离子对色谱法的应用 可用于分离大分子量的
6、阴、阳离子，特别 是带局部电荷的大分子及疏水性阴、阳离 子。包括阴、阳离子表面活剂、大分子脂 肪羧酸、烷基磺酸盐和芳香硫酸盐、季铵 化合物、水溶性维生素、酚类等。3离子对色谱法的应用 可用于分离大分子量的阴、阳离子，特别 是带局部电荷的大分子及疏水性阴、阳离 子。包括阴、阳离子表面活剂、大分子脂 肪羧酸、烷基磺酸盐和芳香硫酸盐、季铵 化合物、水溶性维生素、酚类等。（十）离子排斥色谱法（十）离子排斥色谱法1原理基于固定相和待测物之间三种不同 的作用力-Donnan排斥、空间排斥和吸附作用 分离的。1原理基于固定相和待测物之间三种不同 的作用力-Donnan排斥、空间排斥和吸附作用 分离的。 分离
7、阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换 树脂，分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离 子交换树脂。分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换 树脂，分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离 子交换树脂。如分离阴离子如分离阴离子Cl-和和CH3COO： Cl-在强酸性阳离子交换树脂上形成在强酸性阳离子交换树脂上形成H+Cl-，因受 排斥作用而不能穿过半透膜进入树脂的微孔，它 迅速通过色谱柱而无保留。而，因受 排斥作用而不能穿过半透膜进入树脂的微孔，它 迅速通过色谱柱而无保留。而CH3COO则形成则形成 CH3COOH，可以穿过半透膜进入树脂微孔。，可以穿过半透膜进入树脂微孔。 电解质的离解度越小，则受排斥作用
8、越小，在树 脂中的保留值越大。电解质的离解度越小，则受排斥作用越小，在树 脂中的保留值越大。2离子排斥色谱法的应用离子排斥色谱法的应用主要用于弱的无机弱酸、有机酸、醇类、醛 类、氨基酸和糖类的分离分析。主要用于弱的无机弱酸、有机酸、醇类、醛 类、氨基酸和糖类的分离分析。(十一) 离子色谱法的应用(十一) 离子色谱法的应用1、在生物化学研究中：抗生素、发酵液中阴离子及有机、在生物化学研究中：抗生素、发酵液中阴离子及有机 酸、糖类、蛋白质、寡核苷酸、 氨基酸等的分析。酸、糖类、蛋白质、寡核苷酸、 氨基酸等的分析。 2、环境水、饮用水、生活污水、工业废水、大气中的、环境水、饮用水、生活污水、工业废水
9、、大气中的 无机阴、阳离子、有害物质的价态形态分析。无机阴、阳离子、有害物质的价态形态分析。 3、痕量离子分析（半导体、电场、核电场）、痕量离子分析（半导体、电场、核电场） 4、复杂基体中离子分析（化工原料、海水、卤制品）、复杂基体中离子分析（化工原料、海水、卤制品）5、金属含氧酸的测定（电镀液等）、金属含氧酸的测定（电镀液等） 6、有机化合物分析、有机化合物分析 7、食品、饮料中的有机酸、酸味剂、防腐剂、风 添加剂等、食品、饮料中的有机酸、酸味剂、防腐剂、风 添加剂等 8、有机胺类化合物；、有机胺类化合物； 9、药物和农药（特别是无紫外吸收的化合物）、药物和农药（特别是无紫外吸收的化合物）
10、10、表面活性剂、表面活性剂 11、过渡金属离子的分析、过渡金属离子的分析五五排阻色谱法排阻色谱法 Steric exclusion chromatography(SEC)Steric exclusion chromatography(SEC)排阻色谱又称空间排阻色谱或凝胶色谱法。排阻色谱又称空间排阻色谱或凝胶色谱法。1. 分离原理：1. 分离原理：是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分 离的。是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分 离的。 固定相：是一种表面惰性、具有一定孔径小孔 的多孔凝胶。孔径：数固定相：是一种表面惰性、具有一定孔径小孔 的多孔凝胶。孔径：数nm数百数百nm对流动相分
11、子：可自由出入孔穴对流动相分子：可自由出入孔穴 对溶质分子：对溶质分子： 大分子大分子 不能渗入孔穴中而被排阻，最先流出不能渗入孔穴中而被排阻，最先流出 色谱柱色谱柱. 中等分子中等分子 部分渗透，以中等速度流出色谱柱部分渗透，以中等速度流出色谱柱 小分子小分子 完全渗透，最后流出色谱柱。完全渗透，最后流出色谱柱。 即待测物分子按分子大小即待测物分子按分子大小(分子量大小分子量大小)先后从柱中 流出。先后从柱中 流出。凝胶固定相的排阻极限凝胶固定相的排阻极限A点：点：A点相对分子质量 的分子，均被派拆所有凝胶孔内，以单一谱带析 出，保留体积点相对分子质量 的分子，均被派拆所有凝胶孔内，以单一谱
12、带析 出，保留体积V0相对分子质量洗脱体积相对分子质量洗脱体积VAB全渗透极限全渗透极限B点：点：4000 ，故样品组分为一大于 排阻极限的分子，故样品组分为一大于 排阻极限的分子 V0 VR1 25 ml Vi VR V012525100 ml770100251020=样品iR SECVVVK2. 固定相固定相类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶Sephadax 水 水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分子分离小分子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚
13、乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀较小流速较小溶胀较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、高流速分离刚性大、高流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水3 流动相3 流动相在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离， 而是为了溶解样品，并载带样品流过色谱柱。在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离， 而是为了溶解样品，并载带样品流过色谱柱。 要求：要求： （1）不与试样或填料有任何吸附、分配等作用。）不与试样或填料有任何吸附、分配等作用。 （2）能润湿凝胶和溶解样品）能润湿凝胶和溶解样品 （
14、3）粘度低 （ 分子易扩散），分离效果好。）粘度低 （ 分子易扩散），分离效果好。 （4）沸点通常大于柱温）沸点通常大于柱温2050 （5）与检测器匹配）与检测器匹配 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲 酰胺、三氯甲烷，水等。二甲基甲 酰胺、三氯甲烷，水等。4应用4应用 主要用于大分子的分离、分级主要用于大分子的分离、分级(相对分子质量相对分子质量 为为20002000000)，如蛋白质、核酸等，如蛋白质、核酸等.思考：思考：1、某人用凝胶色谱分离一高聚物，分 离情况很差，他改变流动相组成后，分离 情况大为改进，该说法对吗？、某人用凝胶色谱分离一高聚物
15、，分 离情况很差，他改变流动相组成后，分离 情况大为改进，该说法对吗？ P44610-13 六、亲合色谱简介六、亲合色谱简介利用生物大分子与固定相之间的特异亲合力利用生物大分子与固定相之间的特异亲合力, 进行复杂生物样品的分离及纯化。进行复杂生物样品的分离及纯化。 分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性 能的环氧或联氨，然后再连接上配基，如酶、 抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流 经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特 性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无 此作用的则被洗出；随后，改变流动相分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性 能的环氧或联氨，然后再连接上配基，如酶、 抗原或
16、激素。当含有复杂混合试样的流动相流 经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特 性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无 此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或 组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式 洗脱出来。或 组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式 洗脱出来。 特点：选择性过滤、纯化效果好。特点：选择性过滤、纯化效果好。七色谱分离方法的选择七色谱分离方法的选择要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可 能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉 各种色谱方法的主要特点及其应用范围。要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可 能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉 各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据： 是样品的 对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶 解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、 化学性质。选择色谱分离方法的主要根据： 是样品的 对分子
