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1、2010年版药典附录微生物和无菌检查 法增修定内容年版药典附录微生物和无菌检查 法增修定内容青岛市药品检验所 杜平华 2009年5月起草的指导思想起草的指导思想一、以科学发展观为统领，服务于资源节约 型社会、环境友好型社会的要求；落实科 学监管理念，着力解决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果； 坚持自主与创新；积极推进药品标准化战 略，提高我国药品标准总体水平，着力提 升中国药典在国际社会中的地位和作 用，提高综合竞争力，促进医药产业的健 康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡 献。一、以科学发展观为统领，服务于资源节约 型社会、环境友好型社会的要求；落实科 学监管理念，着力解
2、决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果； 坚持自主与创新；积极推进药品标准化战 略，提高我国药品标准总体水平，着力提 升中国药典在国际社会中的地位和作 用，提高综合竞争力，促进医药产业的健 康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡 献。起草的基本原则起草的基本原则一、坚持保障药品质量、维护人民健康的原则 二、坚持继承、发展、创新的原则 三、坚持科学、实用、规范的原则 四、坚持质量可控性原则 五、坚持标准先进性原则 六、坚持标准发展的国际化原则一、坚持保障药品质量、维护人民健康的原则 二、坚持继承、发展、创新的原则 三、坚持科学、实用、规范的原则 四、坚持质量可控性原则 五、坚持标准
3、先进性原则 六、坚持标准发展的国际化原则微生物限度检查增修定内容删除 供试品检查时使用了表面活性剂证明其有效性及对微生物生长和存活无影响改为无毒性。增加 特殊品种可以最小包装单位报告检验量1、膜剂50cm2一部、二部均改为100cm2沙门菌检验量为30 g或30ml增加了20g其 中10 g用于阳性对照2、液体供试品 水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液做 为供试液. 如限度标准规定;不得检出供试液制备1、 增加贴膏剂供试液制备 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放 置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用 适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴 剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将 其置于适
4、宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30分 钟，或以其它方法制备成供试液。2、具抑菌活性的供试品删除应消除供试液的抑 菌活性后采用下列方法进行处理，以消除供 试液的抑菌活性。离心沉淀集菌法改两次离心为一次离心取规定 量供试液以500转/分离心3分钟后，取全部上 清液用于检查。细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内容细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内容1、增加培养基的适用性检查培养基的适用性检查 菌种菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）26003 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26003 枯草芽孢杆菌
5、（Bacillus subtilis)CMCC(B)63501 白色念珠球菌（Candida sporogenes）CMCC（B）98001 黑曲霉（Asperjillus niger）CMCC（F）98003 菌液制备同无菌检查法适用性检查菌液制备菌种培养基加入菌数 培养温度 培养时间 （cfu）（）（h） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基50100 3035 48枯草芽孢杆菌或营养肉汤培养基黑曲霉改良马丁培养基50100 2328 57天白色念珠球菌改良马丁培养基50100 2328 2448 或改良马丁琼脂 培养基1、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基 中，培养、接种
6、黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基 中，培养57天，加入天，加入35ml 含含0.05（v/v）聚山梨 酯）聚山梨 酯80的的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适 宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适 宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v） 聚山梨酯） 聚山梨酯80的的0.9%无菌氯化钠溶液制成每无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数含孢子数 50100cfu的孢子悬液。的孢子悬液。 2、菌悬液制备后应在菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在小时内使用，若保存在28的 菌悬液可以在的 菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成
7、稳定的孢子 悬液保存在小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子 悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新 鲜孢子悬液使用。，在验证过的贮存期内替代对应量的新 鲜孢子悬液使用。结果判定被检培养基上的菌落平均数与对照培养 基上的菌落平均数相比大于被检培养基上的菌落平均数与对照培养 基上的菌落平均数相比大于70%，且 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落 一致。判该培养基的适用性检查符合规 定。，且 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落 一致。判该培养基的适用性检查符合规 定。增加常见干扰物的中和剂或灭活方法表表1常见干扰物的中和剂或灭活方法常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法
8、干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢纳 酚类、乙醇、吸附物稀释法 醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（戊二醛亚硫酸氢纳 酚类、乙醇、吸附物稀释法 醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACs）、卵磷脂、聚山梨醇酯 对羟基苯甲酸酯 汞类制剂亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物卵磷脂 碘酒、洗必泰类聚山梨醇酯 卤化物硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（）、卵磷脂、聚山梨醇酯 对羟基苯甲酸酯 汞类制剂亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物卵磷脂 碘酒、洗必泰类聚山梨醇酯 卤化物硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA）镁或钙离子 磺胺类对氨基苯甲酸）镁或钙离子 磺胺
9、类对氨基苯甲酸 -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素-内酰胺酶内酰胺酶新增验证试验结果判断新增验证试验结果判断 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作，那 么验证试验中微生物回收的失败可看成是若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作，那 么验证试验中微生物回收的失败可看成是 1、因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该 供试品不能被试验菌污染。、因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该 供试品不能被试验菌污染。 2、供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作 用，而对其他菌株没有抑制作用。、供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作 用，而对其他菌株没有抑制作用。结果判断 根据供试品须符合的限度标准和菌 数报告规则，在不影响
10、检验结果判断的前 提下，应采用能使微生物生长的更高稀释 级的供试液进行方法验证试验。3 、若验证试验符合要求应以该稀释级供 试液作为最低稀释级供试液进行供试品 检查。4、计数方法验证时，采用上述计数方法若 还存在一株或多株试验菌的回收率达不到 要求，那么选择回收情况最接近要求的方 法和试验条件进行供试品的检测。供试品检查增修订内容供试品检查增修订内容平皿法 删去应取适宜的连续23个稀释级的供试 液 培养与计数 1、除另有规定外，细菌培养48小时改为3天，霉菌、 酵母菌培养72小时改为 5天，逐日观察菌落生长 情况；点计菌落数，必要时，可适当延长培养时 间至7天进行菌落计数并报告。 2、菌落蔓延
11、生长成片的平板不宜计数。点计菌落数 后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数 报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落 平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。菌数报告规则增修订内容菌数报告规则增修订内容1、细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于 300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字） 的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数 的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的 菌数。 2、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最 低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数 小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告 菌数。薄膜过滤法薄膜过滤
12、法删去删去每片滤膜的总过滤量不宜过大每片滤膜的总过滤量不宜过大，修改为修改为 总冲洗量不得超过总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜 上的微生物受损伤。，以避免滤膜 上的微生物受损伤。 增加增加 贴膏剂应采用薄膜过滤法进行细菌、 霉菌及酵母菌计数。贴膏剂应采用薄膜过滤法进行细菌、 霉菌及酵母菌计数。控制菌检查增修订内容控制菌检查增修订内容1、增加增加控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用的培养基应进行培养基的适 用性检查，成品培养基、由脱水培养基或 按培养基处方配制的培养基均应检查。检 查项目控制菌检查用的培养基应进行培养基的适 用性检查，成品培养基、由脱
13、水培养基或 按培养基处方配制的培养基均应检查。检 查项目包括培养基的促生长、指示和抑制 特性能力。包括培养基的促生长、指示和抑制 特性能力。菌 种大肠埃希菌大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 0 03 乙型付伤寒沙门菌乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphiCMCC（B）50 94 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌生孢梭菌（Clostridium sporogene
14、s）CMCC（B） 64 941 白色念珠菌白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001菌液制备菌液制备菌种培养基加入菌数 培养温度培养时间 （菌种培养基加入菌数 培养温度培养时间 （cfu）（）（）（）（h） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基10100 3035 1824 乙型付伤寒或营养肉汤培养基 铜绿假单胞菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基乙型付伤寒或营养肉汤培养基 铜绿假单胞菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基 10100 3035 1824 白色念珠球菌改良马丁培养基白色念珠球菌改良马丁培养基10100 2328
15、 2448 或改良马丁琼脂 培养基或改良马丁琼脂 培养基增加 控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的促生长、抑制和指示能力检查控制菌检查用培养基的促生长、抑制和指示能力检查 控制菌检查培养基特性试验菌株 大肠埃希菌胆盐乳糖促生长能力大肠埃希菌 抑制能力金黄色葡萄球菌控制菌检查培养基特性试验菌株 大肠埃希菌胆盐乳糖促生长能力大肠埃希菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力促生长能力+指示能力大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯促生长能力指示能力大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群乳糖胆盐促生长能力大肠埃希菌 抑制能
16、力金黄色葡萄球菌 乳糖发酵促生长能力指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群乳糖胆盐促生长能力大肠埃希菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 乳糖发酵促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯促生长能力指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯促生长能力+指示能力 大肠指示能力 大肠埃希菌埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿促生长能力乙型付伤寒沙门菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂促生长能力沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿促生长能力乙型付伤寒沙门菌 抑制能力金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂促生长能力指示能力乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙
