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1、第2 4 卷增刊 2 0 0 5 年1 1 月分析测试学报 F E N X IC E S H IX U E B A O ( J o u r n a lo fI n s t r u m e n t a lA n M y s i s )V 0 1 2 4N o v 2 0 0 5L C M S 法分析猪尿液中的丙酸睾酮黄士新，曹莹，孙亚云，蒋音，王蓓( 上海市兽药饲料监察所，上海2 0 1 1 0 3 )丙酸睾酮( t e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t e ) 是一种雄激素类药物，长期用于生猪喂养可提高饲料转化率，从而达到增重的目的，兽医临床亦用于同期发
2、情。目前，激素类物质已被大部分国家禁止用于促进动物生长目的，并不得在食品中检出。但国内对饲料和畜产品中激素等违禁药物残留的检测几乎是空白，根据我国对动物源产品残留监控规定及有关进口国的要求，研究开发各种检测方法已成为当务之急。本实验选用液相色谱一质谱联用( L C M S ) 技术测定猪尿中的丙酸睾酮，紧跟国际药物残留检测技术发展趋势，对于防止有害物质进入食物链，保障人民的身体健康意义重大。1实验部分1 1仪器设备液相色谱一质谱联用仪：W a t e r s2 6 9 5 液相色谱仪；W a t e r s9 9 6 二极管阵列检测器；M i c r o m a s sZ Q 4 0 0 0
3、质谱检测器( 配有电喷雾电离源) ；M a s s l y n x 。1 M3 5 色谱管理系统，美国W a t e r s 公司。旋转蒸发器：L A B O R O T A 4 0 0 0 ，德国H e i d o l p h 公司。固相萃取装置：S u p e l c o 公司。1 2 药品与试剂丙酸睾酮对照品：纯度大于9 9 ，S i g m a 公司；甲醇：色谱纯，M e r c k 公司。实验所用其他试剂均为分析纯。固相萃取c 。小柱：1 0 0m g 1m L ，S u p e l c o 公司。1 3 分析条件色谱条件：色谱柱：W a t e r sS u n f i r e l
4、 MC 1 81 5 0m m 2 1m m ，3 5 m ；柱温：3 0o C ；流动相：乙腈一0 2 甲酸( 体积比8 1 ：1 9 ) ；流速：0 2m L m i n ；进样量：2 0 “L 。质谱条件：电离方式：电喷雾电离源( + ) E S I ；离子源温度：1 2 0 ；脱溶剂温度：2 8 0o C ；毛细管电压：3 5 0k V ；锥孔电压：3 5V ；气体流速：2 8 0L h ；R F 六极杆透镜电压：0 5V ；萃取锥孔电压：5V ；离子能量：1 0V ；选择离子监测( S I R ) 质荷比( m z ) ：3 4 5 5 ，2 7 1 5 ，2 5 3 5 。1 4
5、标准溶液的配制丙酸睾酮标准液：精密称取丙酸睾酮对照品，用甲醇配成约2 0 0I - L g m L 对照品贮备液；贮备液再用流动相依次稀释成质量浓度为0 0 0 1 、0 0 0 5 、0 0 1 、0 1 、0 5 、1I x g m L 的对照品工作液。1 5 样品预处理取猪尿液，40 0 0r m i n 离心5m i n ，待用。固相萃取小柱依次用1 0m L 甲醇和1 0m L 水活化，再加入离心后的上清液1 0m L ，经1 0m L5 甲醇溶液淋洗后，用1 0m L 甲醇洗脱待测成分。收集洗脱液，5 0 旋转蒸发至千，用lm L 流动相溶解，经0 2 斗m 滤膜过滤后进样测定。2
6、 结果与讨论2 1色谱图与质谱图丙酸睾酮全扫描质谱图见图1 ，根据质谱图选择m z3 4 5 5 、2 7 1 5 、1 5 3 , 5 为特征离子，对样品进行选择离子监测( 图2 ) 。2 2 不同锥孔电压下丙酸睾酮质谱图丙酸睾酮在锥孔电压3 0V 以下几乎不产生碎片，只有稳定的准分子离子峰 M + H + ，在锥孑L电压增加至5 0V 时有大量碎片峰出现。从以下质谱图( 图3 ) 可以看出在不同锥孔电压下可以得到不同比例的丙酸睾酮碎片离子，在锥孔电压3 5V 时可以得到3 个主要离子 M + H + 、 M + H c 3 H 6 0 2 + 、 M + H C 3 H 6 0 2 一H
7、E 0 + 。2 9 8 第6 期分析测试学报增刊一1 0 02 6 02 8 03 0 03 2 03 4 0m Z图1丙酸睾酮总离子扫描质谱图( 锥孔电压3 5V )1 0 0零J01 0 0摹o2 5 05 0 07 5 01 0 0 0t m i n图2 丙酸睾酮对照品工作液1 0 肛m L 的S I R 色谱图2 5 V；4 。2 1 5 3 52 7 52 8 9 730 1 43 4 1 8b2 6 02 8 03 0 03 2 03 4 0 m ，g1 0 0零 OO6融2 5 4 4 臃2 7 2 5 。z s ，掣，：印尹，弘3 4 (一，2 5 4 1f p 83 1 3
8、 7 r 训挈斌s ? p I 3 4 2 弋I I 。I2 8 03 0 03 2 03 4 0m ，|图3 不同锥孔电压下丙酸睾酮质谱图2 3 标准曲线和回归方程标准曲线各点的质量浓度分别为1 、5 、1 0 、1 0 0 、5 0 0 、10 0 0 g m L ，依次从低浓度到高浓度 进样2 0 灿进行分析，每一浓度进样4 次，按上述色谱和质谱条件进行分析，得到 M + H + 的峰面积和保留时间。取峰面积平均值与标准液浓度绘制校准曲线，并计算回归方程和相关系数。P =2 6 5 7 3 1 0 一A ，P 代表质量浓度，A 代表面积，R 2 = 0 9 9 9 。 2 4 方法回收率
9、的测定取5 0g 空白猪肉配制成含丙酸睾酮分别为1 、1 0 、1 0 0n g g 的样品。按照上述步骤处理，取2 0 汕进L c M S 测定，取峰面积值，计算回收率( 表1 ) 。表1丙酸睾酮的回收率及批内、批间差异2 5 检出限根据标准曲线的最低检出浓度和信噪比的要求( S N 1 3 ) ，丙酸睾酮的最低检出限为1 0 L( S 1 7 6 2 ) ( 图4 ) 。- 2 9 9 - - - | 翥翌4撕瑚狮笙兰堂一分析测试学报增刊1 0 0苯o2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0t r a i n图4 空白猪肉添加1 0 肛g L 丙酸睾酮的S I R 色谱图2
10、6 空白实验取5 0g 空白猪肉按照上述提取和净化步骤处理，所得选择离子峰在标准峰出峰位置附近无干扰( 图5 ) 。摹o1 0 05 9 7畸六水2 0 04 0 06 0 0t m i n图6 空白猪肉S I R 色谱图8 0 02 7 讨论本实验在样品处理过程中利用甾体类药物的亲脂性，通过固相小柱净化，有效地去除了大部分杂质。实验表明，L C M S 在分离、分析尿液中药物残留具有一定的优势。它能满足定性和定量两个方面的要求，是一种较为可靠的检测方法。参考文献： 1 B A B AS ，F U J I O K AM ，S H I N O H A R AY ，e ta 1 D e t e r
11、 m i n a t i o no ft e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t ei nh u m a np l a s m ab yg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y JC h r o m a t o g r ，1 9 8 5 ，3 3 7 ( 2 ) ：2 0 5 2 1 2 2 中华人民共和国药典( 二ooO 版) 二部1 0 4 D e t e r m i n a t i o no fT e s t o s t e r o n eP r o p i o n
12、 a t ei nS w i n eU r i n eb vL C M SH U A N GS h i x i n ，C A OY i n g ，S U NY a - y u n ，J I A N GY i n ，W A N GB e i( S h a n g h a iM u n i c i p a lS u p e r v i s o r yI n s t i t u t eV e t e r i n a r yD r u g sa n dF e e d s t u f f s ，S h a n g h a i2 0 11 0 3 ，C h i n a )A b s t r a c t ：
13、AL C M Sm e t h o df o rt e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t ei ns w i n eu r i n ew a se s t a b l i s h e d H P L Cw i t hac o l u m no f C l 8 1 5 0m mx 2 1m m ( i d ) a n du s i n ga e e t o n i t r i l 一0 2 f o r m i ca c i d ( v o l u m er a t i o8 1 ：1 9 ) a sm o -b i l ep h a s e ，a n df l o wr a t ew a s0 2m L m i n M a s sc o n d i t i o nu s i n g ( + ) E S Ia n dS I Rm o d e K e yw o r d s ：T e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t e ；S w i n eu r i n e ；L C M S一3 0 0
