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1、1空心莲子草正丁醇部位高效液相色谱指纹图谱研究作者：王佳馨， 陈树和， 方念伯， 刘焱文【摘要 】 目的建立空心莲子草正丁醇部位的高效液相色谱（HPLC-ELSD）指纹图谱。方法 HPLC-ELSD 法测定，流动相为乙腈-水梯度洗脱，流速为 1.0 mlmin-1，蒸发光散射（ELSD ）检测器，柱温 35。结果运用梯度洗脱能较好的分离空心莲子草正丁醇部位化合物；经方法学考察，HPLC-ELSD 指纹图谱具有良好的重复性，初步建立了以 12 个共有峰为特征指纹信息的 HPLC-ELSD 指纹图谱。 结论建立的空心莲子草正丁醇部位的 HPLC-ELSD 指纹图谱分析法可为空心莲子草的质量评价提供
2、参考。 【关键词】 空心莲子草； 指纹图谱； 高效液相色谱； 蒸发光散射检测器Abstract:ObjectiveTo establish the HPLC-ELSD of n-butylol froution of Altemanthera philoxeroide.MethodsThe gradient elution was adopted with a mixture consisting of acetonitrile and water, the flow rate was 1.0 mlmin-1，and the detector was ELSD. ResultsThe cons
3、tituents of Altemanthera philoxeroide were well separated on HPLC and the HPLC-FPC 2of 10 batches of samples was established.The results showed that this method had a good repeatability and the 12 common peaks had an exclusive properties.ConclusionThe method developed can supply the reference for th
4、e quality evaluation of Altemanthera philoxeroide.Key words:Altemanthera philoxeroide； Fingerprint chromatography； HPLC； ELSD空心莲子草 Altemanthera philoxeroides (Mart.)Griseb 为苋科(Amaranthaeeae) 莲子草属 Ahemanthera 多年生宿根草本植物, 又名空心苋、螃蜞菊、水花生、喜旱莲子草。据中药大辞典记载：本品之根味苦，性寒；茎叶味微甘，性寒，具有清热、凉血、解毒、利尿的功效，适用于淋症、麻疹、疔疮及热毒诸症
5、。临床研究发现空心莲子草具有抗病毒、抗菌、护肝等作用，被用于治疗流感、麻疹、单纯性疱疹、流行性出血热、黄疸肝炎、乙型肝炎等疾病1 。空心莲子草含有多种化学成分，其中黄酮、三萜和皂苷类是其主要成分2 。空心莲子草主要分布在长江流域，笔者从湖北、湖南、浙江、福建、江西、江苏 6 个省 10 个城市不同地方采集了空心莲子草，采用 HPLC-ELSD 法建立了空心莲子草正丁醇部位的指纹图谱，为空心莲子草的质量评价提供了一定依据。31 仪器与材料1.1 仪器与试剂 Agilent1100 高效液相色谱仪系列，ELSD 检测器（SEDEX 75） ，G1311A 四元梯度泵，G1322A 在线真空脱气装置
6、，G1314A 柱温箱； Mettler Toledo AT20 型分析天平（万分之一） ；KQ-250B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ；HH-S 型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司） ； D101 型大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司） ；微孔滤膜（0.2 m） 。试剂：乙腈（色谱纯） ；醋酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、甲醇（均为分析纯） ；实验用水为二次重蒸水。1.2 药材来源 空心莲子草药材 110 号样品均为 2005-0708分别采自湖北、湖南、浙江、江苏、江西、福建 6 省（均为水中生长） 。见表 1。表 1 样品的来源产地样品号产地 1 江西九江浔阳区白水湖 2 福建
7、福州马尾开发区 3江西鹰潭长途汽车站附近山下 4 福建厦门集美 5 江苏南京浦口区双拢一组 6 江苏徐州 7 江苏无锡惠山区堰桥镇丁塔村 8 湖南怀化 9 湖北黄石 10 浙江湖州道场乡道场村42 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil C18(250 mm4.6 mm,5 m)，流动相为乙腈（ A）- 水（B） ，040 min 乙腈由 5%升到23%，4060 min 乙腈由 23%升到 40%，60 90 min 乙腈由 40%变化到 23%；流速为 1.0 mlmin-1；柱温为 35；ELSD 检测器，压力(3.5 bar),漂移管温度为（ 40） ，喷口温度为 40
8、 ；进样量为10 l。2.2 供试品的制备 精密称取样品粗粉粉末 5.0 g，加入 50%乙醇 50 ml，超声处理 30 min，静置后补足减失乙醇溶液的重量，滤过取续滤液 40 ml；水浴挥去乙醇，用 40ml 蒸馏水溶解，先以醋酸乙酯萃取 4 次（50 ml/40 ml/40 ml/40 ml） ，弃去醋酸乙酯液；水液再用正丁醇萃取 4 次（50 ml/40 ml/40 ml/40 ml） ，弃去水液；水浴挥干正丁醇，残渣用 20 ml 蒸馏水溶解，上样于 D101 大孔树脂柱（8 g） ，用 35 ml 蒸馏水洗脱，弃去水液，再用 50%乙醇 40 ml 洗脱，收集乙醇液，水浴挥干乙醇
9、，残渣用甲醇溶解，定容至 5 ml；经 0.2 m 微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。2.3 方法学考察2.3.1 稳定性实验 取同一批次供试品溶液（样品 5） ，分别在50，3 ，6 ， 9，12 ，24 h 测定指纹图谱，结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积 5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其 RSD 分别为 0.160%1.288%和0.391%2.892%，符合指纹图谱技术要求（ RSD 均在 3%以内） ，说明供试品溶液在 24 h 内测定稳定性良好。2.3.2 精密度实验 取同一批次供试品溶液（样品 5） ，连续进样5 次，测定指纹图谱，考查进样精密度，结果表明各
10、主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积 5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其 RSD 分别为 0.304%1.682%和 0.483%2.885%，符合指纹图谱技术要求（RSD 均在 3%以内） ，说明仪器精密度良好。2.3.3 重复性实验 取样品 5，按供试品制备方法分别制备 5 份供试品，测定指纹图谱。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积 5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其 RSD分别为 0.160%1.288%和 0.391%2.892%，符合指纹图谱技术要求（RSD 均在 3%以内） ，表明方法重复性良好。2.4 指纹图谱的建立 将供试品溶液按选定的测试条件
11、，分别进样检测。测定所有供试品 HPLC-ELSD 色谱图。根据 10 批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和相对保留时间等相关参数，进行分析，比较、制定优化的指纹图谱。见图 1。62.5 指纹图谱分析与评价2.5.1 共有指纹峰标定 根据 10 批空心莲子草供试品的检测结果，比较其色谱图。以相对保留时间标定其共有指纹峰 12 个，以 11 号峰为参照峰（S） ，计算各共有峰相对保留时间，结果 RSD 均小于 3%。见表 2。表 2 共有峰的相对保留时间2.5.2 共有指纹峰面积的比值 根据 10 批空心莲子草供试品的色谱图结果，以参照峰的峰面积为基准，计算各共有指纹峰峰面积与参照峰
12、峰面积的比值及平均比值。结果见表 3。 表 3 共有峰的相对峰面积与参照峰面积比值2.5.3 非共有峰峰面积的比值 计算非共有峰占总面积的比值，结果表明，其比值小于 10%，符合指纹图谱的要求。2.5.4 相似度评价 将测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A） ”软件，经校正，将谱峰自动匹配，然后生成对照指纹图谱，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出空心莲子草 HPLC-ELSD 指纹峰共有模式 R（图 1，2 ） ；与共有模式比较，10 批不同产地空心莲子草的相似度分别为70.943，0.949，0.939，0.853，0.988
13、 ，0.973，0.934，0.729，0.780， 0.934。见图 2。图 1 空心莲子草的指纹图谱图 2 10 批样品的指纹图谱3 讨论本项研究参照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) ，采用高效液相色谱法制定了空心莲子草正丁醇部位的指纹图谱，取得了较满意的研究结果。共标定了 12 个共有指纹峰，方法可靠，重现性、稳定性良好。这为空心莲子草正丁醇部位的开发利用奠定了一定的基础。3.1 供试品溶液制备方法的考察3.1.1 不同提取方法的考察 取同样量的空心莲子草药材粉末，依次用超声波提取法和煎煮法提取并制成供试品溶液，进行 HPLC-ELSD 分析，结果表明，以出峰数目为考察指标，两种
14、方法差异不大，由于超声波法简便、省时，故本实验选用超声波法制备供试品溶液。83.1.2 不同提取醇浓度考察 取同样量的空心莲子草药材粉末，考察了 50%，60%，70%乙醇提纯对峰面积的影响，结果表明浓度差异对结果影响不大，故选择 50%乙醇为提取醇浓度。3.1.3 干扰峰处理方法考察 考察了用聚酰胺树脂纯化，大孔吸附树脂纯化处理方法，发现大孔吸附树脂纯化效果较好，且便于再生处理，综合考虑，选择用大孔吸附树脂纯化为处理干扰峰的最佳方法。3.2 UV 和 ELSD 两种检测方法的比较由于正丁醇部位化合物的UV 吸收波长为末端吸收，采用梯度洗脱时溶剂吸收使基线漂移严重，影响色谱图参数的计算；而采用
15、 ELSD 检测，则梯度洗脱过程中基线平稳3 。所以本实验采用 HPLC-ELSD 对样品进行检测。3.3 相似度分析结果表明，九江、福州、鹰潭、南京、徐州、无锡和湖州产地的空心莲子草相似度较好，厦门、怀化、黄石的空心莲子草 HPLC-ELSD 指纹图谱与其他产区有一些差异。差异主要集中在 2，3，4，5，6，7 号峰的峰形及其相对高度上。产生这些差异的原因是由于空心莲子草正丁醇部位的化合物种类较多，各成分含量差异大，有些成分含量偏小。通过对 10 批空心莲子草正丁醇部位指纹图谱中各共有指纹峰相对峰面积数值的计算和比较，可对9不同产地空心莲子草正丁醇部位化合物的相对含量进行判断。近年来国内外报
16、道了空心莲子草正丁醇部位的一些成分如 3-O-D-吡喃葡萄糖醛基齐墩果酸苷、齐墩果酸-28-O-D-吡喃葡萄糖苷、4，5-dihydroblumenol 等4 。在目前空心莲子草正丁醇部位中的指标性化学成分不是十分清楚的情况下，制定指纹图谱时，没有适宜的对照品或内标物作为参照物，故初步以供试品中峰面积相对较大、较稳定的共有峰作参照峰，来标定其它各共有指纹峰的相对保留时间及计算其它各共有指纹峰面积比值。本实验对空心莲子草 HPLC-ELSD 指纹图谱的构建进行了初步探讨，可为空心莲子草的品质评价、质控标准制定提供参考。【参考文献】 1 江苏新医学院中药大辞典M.上海：上海科学技术出版社，1986：1471.2 熊卫国，刘雅士，刘焱文，等空心莲子草的化学成分研究J. 中草药，2000，31(7)：501.3 魏 泱，丁明玉蒸发光散射检测技术J . 色谱，2000，18(5)：399.10
