《CHOdhfr细胞改造的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CHOdhfr细胞改造的研究（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Y8 0 2 _ 7 5 1分类号U D C博士学位论文密级作者姓名盗凌蝰指导教师盒缝湮培养单位茎塞医堂弛堂医生毖王程班究逝专业名称遗挂堂论文提交日期兰壅垦垂生至且主土璺学位授予单位生圈厶鲢热墨墨蔓堕堂盎堂瞳中国人民解放军军事医学科学院制缩略词表英文缩略词表英文摘要T h eM o d i f i c a t i o no fC H o - d h f l fC e U sf o rB i o p h a r m a c e u t i c a lP r o d u c t i o nC H O d h f r c e l li st h em o s ti m p o r t a n th
2、o s t c e l lf o rb i o p h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n ，h o w e v e r ，t h e r ea r es o m ep r o b l e m ss t il le x i s t i n gi nC H O d h f r c e l lc u l t u r i n g I no r d e rt om a k eC H 0 一d h f r c e l lm o r es u i t a b l ef o rc u l t u r i n go nal a r g es c a l e ，w em o
3、 d i f i e dt h ec e l lb ys t e a d yi n t e g r a t i n gt h ea n t i a p o p t o s i sg e n eB c l 一2i ng e n o m eo fC H 0 一d h f r u s e dt h eF 1 pt a r g e ti n t e g r a t i n gs y s t e m F i r s t l y ，h u m a na n t i a p o p t o s i sg e n eB c l 一2w a st a r g e ti n t e g r a t e di n
4、t oC H 0 一d h f r c e l la n do v e r e x p r e s s e d T h ev i a b i l i t yO ft h er e c o n s t r u c t i n gc e l li n c r e a s e dt of a c et h ei n d u c t i v ea p o p t o s i sf a c t o r ss u c ha sc u l t u r i n gi ns e r u r r I - f r e ea n di nh i g h c o n c e n t r a t i o na m o n
5、 i ai o n A sa c c u m u l a t i o no fL a c t i ca c i dw h i c hi sak i n do fs i d ep r o d u c t sc a no b v i o u s l yi n f l u e n c et h eg r o W t ho ft h ec e l l I no r d e rt or e d u c el a c t a t ef o 珈a t i o ni nt h ec e l lc u l t u r eb yg e n e t i c a l l ym a n i p u l a t i o
6、no ft h ep a t h w a yo f1 a c t a t es y n t h e s i s ，4R N A it a r g e t sw e r es e l e c t e di nt h eL D H - Ag e n eo fC H o - d h f r c e l l F o u rD N As e q u e n c et op r o d u c ec o r r e s p o n d i n gs h R N Ai sd e s i g n e da n dc l o n e di nt h el o w e rp o s i t i o no ft h
7、 ee x p r e s s i n gv e c t o rp A V U 6 s h R N At o w a r dL D H Ag e n eo fC H 0 一d h f r c a nb ee x p r e s s e dc o n t i n u o u s l yb ys t e a d yi n t e g r a t i n ge x p r e s s i n gv e c t o rw i t h i ng e n o m eo fC H O d h f r c e l l 0 n ec e l l1 i n ew a ss c r e e n e do u tf
8、r o mt h e4r e c o n s t r u c t i n gc e l l s1 i n e s 。t h er e s u l to fa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eL D H Am R N A ，t h ea c c u m u l a t i o no fl a c t a t e ，c e l la p o p t o s i si nm e d i u ma 1 1d e c r e a s e d ，t h ed e n s i t yo fc e l lc u l t u r i n gc l i n g i n gt
9、 ow a l l si n c r e a s e db y1 1 4 T h et h i r dp a r to ft h ej o bw a st oc o n t r o lt h ec e l lp r 0 1 i f e r a t i o nb i o p r o c e s s e sB e c a u s et h eo v e rp r o l i f e r a t i o no ft h ec e l li nc u l t u r i n gp r o c e s sw a su n f a v o r a b l ef o rt h eh e t e r 0 1
10、0 9 0 u sp r o t e i np r o d u c t i o n ，g r o w t hs t a g n a t i o ni s3英文摘要f a v o r a b l ef o ri n c r e a s i n gt h eh e t e r o l o g o u sp r o t e i np r o d u c t i o nw h e nt h eo p t i m a ld e n s i t yo fc e l l sh a sb e e nr e a c h e d A i m i n ga te s t a b l i s h i n gs t e
11、 a d yi n t e g r a t i o na n dg e t t i n gt h er e c o n s t r u c t i n gc e l ll i n ei n d u c t i V et oe x p r e s sp 2 7g e n e t h er e c o n s t r u c t i n gc e l ll i n e ，w h i c hc o u l de x p r e s sT e t Rh i g h l y ，w a ss c r e e n e do u t ，b yc o n t r o l l i n gt h ep r o p
12、r o l i f e r a t i o no ft h ec e l le x p r e s s i n gp 2 7t os t a g n a t et h ep r o p r 0 1 i f e r a t i o no ft h ec e l la n dt w o s t e pr e c o n s t r u c t i n gw i t ha p p l y i n gt h eT R E x 州i n d u c t i v ee x p r e s s i n gs y s t e m 0 ns u c hb a s i s ，t a r g e ti n t e
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14、 lc y c l ec o u l db er e s t r a i n e de f f e c t i v e l ya n ds t a g n a t e di nG 1p h a s e E x a m i n i n gE G F Ps h o w st h a tt h ee x p r e s s i n gr a t eo fE G F Pb yc e l li n c r e a s e sb y7 0 w h e nt h eg r o w t ho fc e l li su n d e rs t a g n a t i o n K e y w o r d s ：C
15、H 0 _ _ d h f r 一，c e l lc u l t u r e ，a p o p t o s i s ，l a c t a t eP r o p r 0 1 i f e r a t i o n i n h i b i t e d4引言引言重组蛋白药物具有巨大的社会效益和经济利益，被称为二十一纪的钻石产业。利用哺乳动物表达系统表达药用蛋白是生物制药工业的主要发展方向，在2 0 0 4 年前六个月，销售额超过2 0 亿美元的前6 位的生物技术药物全部是哺乳动物细胞表达的产品，并且以c H O 细胞表达为主。作为目前重组糖基化蛋白生产的首选宿主。1 ，c H 0 细胞表达系统具有原核细
16、胞和和低等真核表达细胞无法比拟的优点：具有准确的翻译后修饰功能，在正常的氨基酸位置上发生糖基化，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。1 ，能正确组装多亚基蛋白；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化：对外源基因的整合稳定，并能进行高效扩增和表达；具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压的能力，可以进行悬浮培养：c H O 细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离“1 。但是c H 0 细胞本身存在着培养成本高，表达量低，细胞生长周期长，生长条件难以控制，易污染等问题，在一定程度上影响了它的广泛应用。为了实现重组药物在细胞内的高效表达，涉及到几个关键环节：载体系统、c H O 细胞表达体系、大规模培养。随着基因工程技术的发展，人们对载体系统的改造做了大量的工作：分离了C 州、E F la 等强启动子”1 ；采用了对选择标记d h f r 或G S 加压，使与之串联表达的外源基因同时得以扩增嗣。在细胞大规模培养方面，人们
