新疆农业大学硕士学位论文苜蓿花药愈伤组织继代和分化及再生培养条件的优化姓名：李增红申请学位级别：硕士专业：草业科学指导教师：张博20080501摘要本实验以苜蓿花药为材料诱导出愈伤组织，进行继代培养和诱导再生植株，旨在研究这一过程中继代与分化培养条件优化、继代与生根培养基的优化实验还初步研究了流式细胞法对苜蓿染色体倍性的鉴定，为完善苜蓿D H 系的构建提供科学依据研究结果如下：①花药愈伤继代培养中M S 和N 6 大量元素培养基交替使用，愈伤组织的增值和颜色要好于单一使用②继代培养的第1 - 5 代生长素添加量为2 m g ／1 ，增值培养阶段为0 “ - - - 0 ．5m g ／1 ，继代培养第6 —1 0 为1 ．5 - 2 ．5m g ／1 ，添加防褐物质A C0 ．8 9 ／1 ，为花药愈伤继代培养较优的生长素组合方式③L H 用量为0 ．8 一l g ／1 不仅能增加愈伤组织的生物量，且具有防褐化的作用④分化培养中愈伤组织长出松散的绿点时，要及时将细胞分裂素浓度降到2 ．O m g ／1 以下，否则，愈伤较易褐化或形成畸形苗⑤激素、大量元素等因素正交实验的结果表明，2 ，4 一D 和大量元素对愈伤组织体积增加的差异显著( F > 3 ．0 9 6 ，P 3 ．0 9 6 ，P 二硫苏糖醇( D T T ) > 抗坏血酸( V c ) > 活性炭( A C ) > 硫代硫酸钠( S T ) > 柠檬酸( c A ) > 琉基乙醇( B M E ) 。
由表2 - 1 2 可知：S 3 培养基对其颜色和形态后期培养最差，整体上看，在后期培养中都有褐化加重趋势培养基中添加A C 、L H 、P V P ．4 0 对苜蓿花药愈伤组织继代培养中的生长和防止褐变作用明显值得注意的是当褐变现象不再发生时，要及时停止添加P V P ，以防长期使用P V P 对外植体产生毒副作用表2 ．1 2 添加活性炭、水解乳蛋白和聚乙烯毗咯烷酮对愈伤组织继代培养及分化影响的结果T a b l e 2 ．1 2E f f e c to f A C ．L Ha n dP V P ·4 0o nc a l l u ss u b c u l t u r ea n dd i f f e r e n t i a t i o n2 ．5 继代培养的正交实验结果与分析接种1 8 和3 8 天时，统计愈伤组织体积( 长×宽×高) 增大倍数，试验结果( 试验结果为各重复的平均值) 见表2 1 3 对数据进行直观分析、方差分析和多重比较2 ．5 ．1 强光条件下正交实验结果与分析( 1 ) 强光条件下愈伤组织继代培养前期体积增长倍数新疆农业大学颐±学位f ^ 文表2 ．1 3 三组光照条件下正交实验愈伤组织体积增值倍数的平均值T a b l c 2 ，1 3T h ea v e r a g eo f a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e su n d e rt h r e el i g h tc o n d i t i o n s ’O r t h o g o n a lt e s t处理号强光强光前期后期强光全程弱光前期弱光后期弱光全程无光前期无光后期无光全程-_----_—_——————_—_—_-———_————————————————-—————-———————————_—__--———_—_——-_-_—————————●_--—-——_—_——————_————————_—————————————————————一一一l1 ．5 00 ．9 41 ．3 61 ．0 01 ．0 01 ．o o1 ．0 01 ．o o1 ．0 022 ，9 9l ，3 94 ．0 35 ，1 2l ，1 05 ，2 22 ．7 63 ，1 0S ，4 333 ．1 52 ．3 47 ．2 22 ．7 32 ．1 55 ．2 63 ．2 93 ．1 21 0 ．0 243 ．2 71 ．7 05 ，7 33 ．4 91 ．4 04 ，9 72 ，8 62 ．7 l8 ．3 251 ．1 l1 ．o ol 。
l l1 ．1 91 ．o o1 ．1 91 ．0 01 ．0 31 ．0 363 8 8I S 47 2 82 ，7 70 ．9 82 ，7 53 ，“2 ．9 l5 ．4 573 ．O l2 ．7 78 ．6 l1 ．4 32 ．3 83 ．5 32 ．4 23 ．1 67 ．0 6S3 ．2 02 ．3 6S ，9 63 ，4 72 ．4 29 ．6 63 ，1 52 ，1 66 ．8 092 ．0 81 ．8 23 ．7 02 ．1 31 ．0 02 ．1 31 ．9 91 ．0 01 ．9 9I OI ，5 0l ，0 6I ，6 22 ，裾l T 3 03 ．6 8l ，册1 ．∞l ，∞1 12 ．8 71 ．9 l5 ．4 23 ．1 41 ．3 54 ．7 03 ．2 11 ．1 33 ．3 81 2l ，9 32 9 8，．穆2 ，了6l ，4 93 ．6 23 ，乃l ，∞3 ，2 51 32 ．3 01 ．5 33 ．8 92 ．4 61 ．2 l3 ．5 31 ．1 91 ．0 01 ．1 91 43 ．4 92 ．5 39 ，7 93 ，0 31 ．8 85 ，7 9I ，9 94 ，4 59 ．2 31 52 ．9 42 ．7 97 ．9 02 ．4 11 ．5 l3 ．6 53 ．1 92 ．5 77 ．9 01 63 ．5 02 ．2 97 ．4 34 ．1 8I ．8 06 ．2 24 ．7 I2 ，7 29 ．5 7注：强光前期为强光条件下愈伤组织一次继代培养前1 8 天体积增加平均倍数，强光后职为强光条件下愈伤组织一次继代培养第1 9 到3 9 天体积增加平均倍数，强光全程为强光条件下愈伤组织一次缝代培养3 8 天体积增加的平均倍数，弱觅和无光都同强光a强光条件下愈伤组织继代培养前期增值平均倍数的直观分析见表2 - 1 4 。
根据极差的大小顺序排出顺序，影响继代培养增值倍数的因素主次顺序为2 ，4 ．D > 大量元素> 6 ·B A > A C > L H 各因素的最优水平为大量元素N 6 ，2 ，4 - Dl m 鲋，6 - B A0 ．1 m g ／l ，A C2 ．4 鲫，L H0 ．8 9 ／1 蓖蓿纯药愈伤组织继代秘分化及1 l } 生培养条件的优化表2 ．1 4强光条件下前期愈伤组织增长倍数直观分析T a b l e 2 —1 4T h ea v e r a g eo f a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e sf o ri n t u i t i v ea n a l y s i su n d e rs t r o n gl i g h tc o n d i t i o n s( 2 ) 强光条件下愈伤组织继代培养前期体积增长倍数方差分析结果表2 ．1 5愈伤组织生长1 8 天体积平均增加倍数方差分析结果T a b l e 2 —1 5T h ea v e r a g eo f a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e sv a r i a n c ea n a l y s i sr e s u l t sf o rt h e0 - 1 8 t hd a y sD e p e n d e n tV a r i a b l e ：增加倍数( a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e s )aRS q u a r e d = ．315 ( A d j u s t e dRS q u a r e d = ．2 2 6 )结果表明，2 ，4 ．D 对强光条件下愈伤组织继代培养前期体积增加倍数的影响最大，2 ，4 一D 和大量元素都达到了极显著水平( P 大量元素> 6 一B A > A C > L H 。
方差分析的结果与直观分析的结果一致 3 ) 强光条件下愈伤组织继代培养前期体积增长倍数主效应因素的多重比较本试验结果表明，试验的五因素中2 ，4 - D 和大量元素不同水平对愈伤组织的体积增加差异极显著从大量元素的四个水平结果看，A 3 最低，即S H 的大量元素最不适合做愈伤组织的继代培养，全量的M S 要好于1 ／2 M S ，最好的为N 6 从2 ，4 ．D 的四水平结果看，B 1 和其它三水平结果的差别很大，且B 2 、B 3 、B 4 的值接近，处于中间的B 3 最大，说明愈伤组织继代培养加一定量的生长素是必要的，但量不宣超过2 m g ／l ) 强光条件下愈伤组织继代培养后期体积增长倍数直观分析结果表2 ．1 6 强光条件下后期愈伤组织增长倍数直观分析结果T a b l e 2 - 1 6T h ea v e r a g eo f a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e sf o ri n t u i t i v ea n a l y s i su n d e rs t r o n gl i g h tc o n d i t i o n si nl a s t结果表明：强光条件下继代培养后期增值倍数平均数的直观分析见表2 ．1 6 。
根据极差的大小顺序排出影响继代培养增值倍数的因素，主次顺序为2 ，4 ．D > 大量元素> A C > 6 ．B A > L H 各因素的最优水平为大量元素N 6 ，2 , 4 一Dl m 刚，6 - B A0 ．1 m 鲋，A C0 9 ／l ，L H1 ．6 9 ／l 5 ) 强光条件下愈伤组织继代培养后期体积增长倍数方差分析结果结果表明，继代培养后期不同大量元素和2 ，4 ．D 、A C 、6 B A 对愈伤组织体积增大影响极显著( P 大量元素>A C > 6 - B A > L H 方差分析的结果与直观分析的结果基本一致3 l苜蓿花药愈伤组织继代和分化及再生培养条件的优化表2 - 1 7 强光条件下后期( 1 8 ．3 8 ) 体积平均增加倍数方差分析结果T a b l e 2 - 1 7T h ea v e r a g eo f a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e sv a r i a n c ea n a l y s i sr e s u l t ss t r o n gl i g h tc o n d i t i o n sf o rt h e1 8 - 3 8 t hd a y sD e p e n d e n tV a r i a b l e ：增加倍数( a d d e dc a l l u sv o l u m em u l t i p l e s )aRS q u a r e d = ．415 ( A d j u s t e dRS q u a r e d = ．3 3 9 )( 6 ) 强光条件下愈伤组织继代培养后期体积增长倍数主效应因素的多重比较本试验结果表明，试验的五因素中2 ，4 ．D 和大量元素、A C 、6 - B A 不同水平对愈伤组织的体积增加差异极显著。
从大量元素的四个水平结果看，最好的水平和前期相同，仍为N 6 A 1 最低，即1 ／2 M S 的大量元素最低且数值差较大，而前期最低值是S H ，说明一次继代培养时间不宜过长，否则后期会因营养不足而停止生长，甚至老化死亡从2 ，4 ．D 的四水平结果看，B l 、B 2 和B 3 、B 4 结果的差别很大，最高值仍为B 3 ，此处也说明到后期培养基中的各种成分消耗量大，量少的情况下会供应不上愈伤组织的生长6 - B A 的四个值差均较大，不难得出愈伤组织增值继代培养的最佳值为0 ．1。