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1、广州医学院硕士学位论文低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键凋亡蛋白的活化姓名：徐厚巍申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：刘海鹰20100501广州医学院硕士学位论文 低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键凋亡蛋白的活化 1低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键 凋亡蛋白的活化凋亡蛋白的活化 专专 业：业： 外科学外科学 研究生：研究生： 徐厚巍徐厚巍 导导 师：师： 刘海鹰刘海鹰 教授教授 摘摘 要要 背景背景 大肠癌是目前全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率有明显的上升趋势，在我国大肠癌的发病率也逐年上升，并且已经成为我们城市人口癌症死亡
2、的第 4 位。化疗是肿瘤治疗的重要组成部分，在过去的三十年内，化疗使肿瘤治疗的效果得到了很大程度的提高。 目前临床上影响肿瘤化疗效果进一步提高存在两个主要障碍，一是癌细胞对化疗药物的的不敏感或是获得性的耐药；二是化疗药物对一些重要的组织和器官存在的非特异性的毒性， 限制化疗药物有效剂量的提高。 由于化疗导致的系统性毒性和药物耐药是肿瘤化疗成功的主要障碍。 而新的分子靶向药物也存在价格昂贵和耐药问题， 从食物中提取有效成分抑制肿瘤生长和转移活性并有可能增强化疗药物的研究越来越引起重视。 研究发现低分子柑橘果胶（MCP）具有抗肿瘤转移的活性，同时 MCP 作为一种天然的成分没有明显的毒副作用。 我
3、们的前期研究发现 MCP 不但对于结直肠癌肝转移灶的形成有抑制作用，而且对于原发灶也有一定的限制作用。MCP 的抗转移活性已经得到认可，其抗转移的作用靶点和分子机理已证实,但目前对于 MCP 抑制肿瘤细胞生长的机制仍不清楚，已有报道 MCP 对黑色素瘤细胞具有一定的杀伤活性，与外源性的凋亡途径有激活有关。因此我们推测 MCP 对结直肠癌肿瘤细胞也具有一定的杀伤活性。 广州医学院硕士学位论文 低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键凋亡蛋白的活化 2目的：目的： 研究低分子果胶（MCP）对结肠癌肿瘤细胞生长的杀伤作用，并初步探讨其分子机制。 方法：方法： 1、 细胞株；人结肠癌细胞株 SW116、
4、HCT116、HT-29、SW620、SW480。 2、 MTT 法评价不同浓度 MCP 处理 48 小时对上述不同人结肠癌细胞株的体外抑制增殖的作用和明确 MCP 对上述实体瘤细胞的 IC50 值。 3、 显微镜观察不同浓度 MCP 处理 24 小时后人结肠癌细胞形态的改变。 4、 流式细胞仪检测 2.5mg/mlMCP 对人结肠癌细胞处理 24 小时后凋亡比例。 5、 Western blotting 检测不同浓度 MCP 处理抑制作用较强的细胞株 48 小时后 Caspase-8，Caspase-9，Caspase-3，PARP 蛋白表达水平的变化情况。 结果：结果： 1、MCP 对结肠
5、癌细胞株 SW116、HCT116、HT-29、SW620、SW480 均有抑制作用，且呈浓度依赖性，HCT116 最敏感。因低分子柑橘果胶的溶解度问题，高浓度无法溶解， 故MTT实验无法顺利完成， 可几乎完全溶解的浓度5mg/ml。 2 显微镜观察浓度为2.5mg/mlMCP对结肠癌细胞株处理24小时后细胞形态学改变，因为MCP即使是低浓度溶解后液面仍较浑浊，所以无法观察到细胞的形态，更无法观察到细胞凋亡的特征。 3 采用流式细胞仪检测浓度为2.5mg/ml的MCP作用于大肠癌SW116、HCT116、HT-29、SW620、SW480、细胞24小时后的凋亡细胞比例情况。发现MCP处理后凋亡
6、细胞比例与空白对照组相比有显著提高，统计学分析差异有显著意义（P90）9。所以，MCP 能有效的抑制肿瘤细胞粘附内皮细胞、同型肿瘤细胞聚集、血管内转移灶的形成以及对靶器官的侵犯。 c 拮抗肿瘤细胞侵犯靶器官实质 肿瘤细胞在靶器官微血管中沉淀后，能在血管内增殖直到转移的肿瘤细胞侵犯出血管壁转移到靶器官实质14。而这种侵犯主要依靠肿瘤细胞的转移能力，包括多种肿瘤细胞与细胞外基质作用的蛋白，MCP 抑制 gla-3 介导的肿瘤细胞与 ECM 蛋白如层粘连蛋白的作用已有报道， 同时 CP 能够剂量依赖性的抑制高转移性的乳腺癌细胞 MDA-MB-231 对人内皮细胞基质胶的侵犯。基于以上结果，可以推测
7、MCP 能抑制不同肿瘤细胞对侵犯靶器官实质的能力。 d 抑制早期转移灶中肿瘤细胞增殖 肿瘤细胞被靶器官识别侵犯出血管后，大量的肿瘤细胞被诱导凋亡，只有小部分(2%)能够存活并形成微小转移灶15。最初的转移灶形成是转移过程中一个重要的限制性步骤，作为 MCP 的目的蛋白，galectin-3 是一个重要调节肿瘤细胞凋亡的因子。 大量的研究详细证实了 galectin-3 是如何保护肿瘤细胞避免凋亡，更重要的是 galectin-3 是通过影响内源性凋亡通路（线粒体途径）发挥其抗凋亡作用16-18，在循环及转移灶肿瘤细胞的存活中起关键作用。galectin-3 抗凋亡的机能可能是 MCP 新的作用
8、靶点（20），通过 MCP 抑制galectin-3 能够减少循环及转移灶肿瘤细胞的存活。这种机制在抑制骨肉瘤转移灶的形成得到证实，而且这种抑制有肿瘤细胞的凋亡增加有关6。所以，早期转移灶的克隆源细胞是不是 MCP 的另一个靶点呢？ (2). MCP 对肿瘤血管生成的影响 微小转移灶形成、生长与新生血管的形成密切相关。galectin-3 是一个和血管发生有密切关系的蛋白19，其能引导内皮细胞产生运动性侵犯基质层从而诱导新生毛细血管生成。所以，人们推测 MCP 通过抑制 galectin-3 能抑制广州医学院硕士学位论文 低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键凋亡蛋白的活化 37肿瘤血管的形成
9、，已得到证实。MCP 能封闭人内皮细胞对 galectin-3 的趋化性，并有剂量依赖性，浓度为 0.005能够封闭 68，1的 MCP 可以完全封闭肿瘤细胞与脐静脉内皮细胞的结合20。 MCP 同样可以抑制内皮细胞形成新的毛细血管。 目前抗肿瘤的血管生成时肿瘤治疗的一个很重要的治疗方式，而 MCP 的这种特性是有望成为一种新的靶向抗肿瘤药物。 (3). MCP 对肿瘤细胞化疗耐药性的影响 大量的抗癌药物是通过引导内源性凋亡信号通路（线粒体途径）诱导肿瘤细胞凋亡的。32 研究进展表明，galectin-3 是肿瘤凋亡的重要的调节因子，它能抑制线粒体凋亡途径21，22，因而 galectin-3
10、 能够调节肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，例如顺铂、阿霉素等。所以 MCP 作为 gal-3 的抑制剂，具有通过抵抗 gal-3 其抑制线粒体凋亡途径改变肿瘤细胞敏感性的潜力， 如果这是可行的，将具有深远的意义，不仅对于肿瘤转移灶的控制和治疗，而且对于总体的肿瘤治疗都会有很大的收益。 最近的研究提示 MCP 能够显著的提高骨髓肉瘤对于阿霉素诱导的凋亡作用6，这些结果能强有力的说明对于galectin-3表达的肿瘤细胞在化疗方案中加用MCP能够显著提高治疗的疗效。 更有趣的是，在最近的研究中 MCP 不仅可以提高细胞毒性药物的促凋亡作用而且其本身也具有促凋亡作用，主要是通过外源性凋亡途径（cas
11、pase-8-caspase-3）23，即在线粒体膜电位没有变化的情况下也是可以诱导凋亡的。 （4） 结论： 因为其抗粘附、 促进诱导凋亡等特性， MCP 可以影响肿瘤细胞转移过程中的多个关键步骤 （图 1） 。 同时 MCP 抑制 galectin-3 的抗凋亡功能以及提高化疗药物的促凋亡毒性， 也许 MCP 能显著提高传统化疗有效性。 然而在成为一个有效抗肿瘤药物的探索过程中，MCP 临床研究遇到了很多的问题。在有限的临床试验中证明在复发的前列腺癌患者中能明显增加前列腺特异性抗原的倍增时间31，所以肯定了其在前列腺癌有效性。目前 MCP 只是用为营养制剂， 而其多种抗肿瘤特性使其有望成为一
12、种治疗多种人类肿瘤的抗癌药物。 广州医学院硕士学位论文 低分子柑橘果胶杀伤结肠癌细胞过程中关键凋亡蛋白的活化 38参考文献参考文献 1. Pienta, K. J.; Naik, H.; Akhtar, A.; Yamazaki, K.; Replogle, T. S.; Lehr, J.; Donat, T.L.; Tait, L.; Hogan, V.; Raz, A. J. Natl. Cancer Inst. 1995, 87, 348353. 2 Glinskii, O. V.; Huxley, V. H.; Glinsky, G. V.; Pienta, K. J.; Raz, A
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