《卵巢癌相关成纤维细胞CAFs的分离培养及其对卵巢癌细胞的生物学影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《卵巢癌相关成纤维细胞CAFs的分离培养及其对卵巢癌细胞的生物学影响（97页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学博士学位论文卵巢癌相关成纤维细胞CAFs的分离培养及其对卵巢癌细胞的生 物学影响姓名：王晓翊申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：王泽华20080501华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 中英文缩略词表中英文缩略词表 CAFs Carcinoma-associated fibroblasts 癌相关成纤维细胞 NFs Normal fibroblasts 正常成纤维细胞 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链技术 DMEM/F12
2、Dulbeclo MEM/F12 DMEM/F12培养基 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 bp Base pair 碱基对 DEPC Diethyl pryocarbonate 焦碳酸二乙酯 DAB Diaminobenzidine 二氨基联苯胺 DMSO Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 dNTP Deoxybonncleoside tri phosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 cDNA Complemengary deoxyribonucleic acid 互补脱氧核糖核酸 PBS Phosphate balanced solution 磷酸
3、盐缓冲液 -SMA -smooth muscle actin -平滑肌肌动蛋白 FAP Fibroblast-activation protein 成纤维细胞活化蛋白 PI Propidium lodide 碘化丙啶 FGF Fibroblast growth factor 成纤维细胞生长因子 tTG tissue Transglutaminase 组织转谷氨酰胺酶 PDGF Platelet-derived growth factor 血小板源性生长因子 CXCL12 CXC chemokine ligand-12 CXC类趋化因子12 TGF- Transforming growth fa
4、ctor- 转化生长因子 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen 增殖细胞核抗原 MMPs Matrix metalloproteinases 基质金属蛋白酶 ERK Extracellular signal-regulated kinase 细胞外信号调节激酶 PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase 磷脂酰肌醇(-3)激酶 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 COX-2 Cyclooxygenase 2 环氧合酶2 IL-6 Interleukin-6 白细胞介
5、素-6 VEGF Vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子 TIMPs Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 金属蛋白酶组织抑制剂 EZH2 Enhancer of Zeste Homolog 2 组蛋白甲基化转移酶 HE Hematoxylin and Eosin Staining 苏木素-伊红染色 ECM Extracellular matrix 细胞外基质 MVD Microvessel Density 微血管密度 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的
6、研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_
7、年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 实验流程图实验流程图 卵巢癌组织正常卵巢组织 细胞鉴定 比较 CAFs 与 NFs 两种细胞基因表达差异与卵巢癌细胞 CAOV3 共培养 检测 细胞 增殖 检测 细胞 迁移 活力 检测 CAOV3 和 CAFs 细 胞基因表达 变化及相关 传导通路 观 察 各 组 裸 鼠 肿 瘤 的 生 长 状 态 及 裸 鼠 存活时间 免 疫 组 化 检 测 各
8、组 裸 鼠 肿 瘤 中 FANCF 蛋白 体内水平体内水平分析CAFs对卵巢癌增殖 和侵袭的作用 体外水平体外水平分析 CAFs 对 CAOV3 细 胞的生物学影响及其对肿瘤生长 的作用机制及信号传导通路 结合体内体外结果分析结合体内体外结果分析 CAFs 的生物学变化，及其在卵巢 癌进展中的作用，以及产生此作用的相关分子机制和信号 传导通路，为临床治疗提供新的研究思路 的生物学变化，及其在卵巢 癌进展中的作用，以及产生此作用的相关分子机制和信号 传导通路，为临床治疗提供新的研究思路 分离培养 CAFs 分离培养 NFs 细胞电镜 和倒置显 微镜形态 观察 免疫 细胞 化学 鉴定 RT-PCR
9、 检测 mRNA RT-PCR 检测 mRNA检测 细胞 凋亡Annexi n-V/PI 测细胞 凋亡 PI 测 细胞 周期PCNA 表达 检测 细胞 增殖 Transwell 和 Matrigel 检测体外 迁移 CAFs 与 CAOV3 共同 注入裸鼠体内建立体 内模型 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 卵巢癌相关成纤维细胞的分离培养及其卵巢癌相关成纤维细胞的分离培养及其 对卵巢癌细胞的生物学影响对卵巢癌细胞的生物学影响 中中 文文 摘摘 要要 第一部分第一部分 卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的分离培养鉴定及两者基因
10、表达差异卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的分离培养鉴定及两者基因表达差异 目的目的 对卵巢癌相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）及卵巢正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）进行分离、培养、纯化、并作初步的鉴定。分析 CAFs 与 NFs 中多种基因表达的差异。 方法方法 1.用组织块贴壁培养法获得原代卵巢癌CAFs和卵巢NFs， 细胞铺满培养瓶后首次传代，通过胰酶消化法和反复传代法进行细胞的纯化；2.通过倒置显微镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞内部结构和多种蛋白质的免疫细胞组化染色检测细胞膜波形蛋白（vim
11、entin） 、细胞角蛋白（keratin）和-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA） ，及相应mRNA的半定量分析，对CAFs和NFs进行初步鉴定；3.应用RT-PCR的方法对CAFs和NFs中多种基因进行分析比较。 结果结果 1.获得了纯化的卵巢CAFs和NFs；2.卵巢CAFs呈长梭形，胞质突减少，电镜下可见粗面内质网扩张；3.卵巢CAFs的细胞免疫组化染色波形蛋白、-SMA染色呈阳性,角蛋白呈阴性，卵巢NFs波形蛋白阳性，而-SMA和细胞角蛋白阴性；4.卵巢CAFs与NFs中波形蛋白与-SMA的mRNA发现均有表达，但CAFs中表达增加，差异有显著性（P0
12、.05） ；5.与NFs相比，CAFs中多种mRNA的表达增加，其中包括有生长因子，基质金属蛋白酶，血管生成因子，同时也发现MMP1的表达显著减少。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 结论结论 与NFs相比, CAFs在形态结构、mRNA、蛋白表达等方面均有显著差异；卵巢癌中CAFs的直接分子表达的检测表明， 其分子表达有显著变化，提示这些成纤维细胞可能为卵巢癌细胞的生长提供了最适的微环境。 推测卵巢-宿主界面微环境在上皮性卵巢癌的发展中可能起重要作用。 关键词关键词 卵巢肿瘤；癌相关成纤维细胞 CAFs；波形蛋白；细胞角蛋白；平
13、滑肌肌动蛋白 -SMA；成纤维细胞活化蛋白 FAP 第二部分第二部分 卵巢癌相关成纤维细胞对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的生物学活性的影响卵巢癌相关成纤维细胞对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的生物学活性的影响 目的目的 采用 Transwell 体外间接共培养体系， 研究直接分离自卵巢癌的癌相关成纤维细胞 CAFs 对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭活性的影响，探讨 CAFs 在上皮性卵巢癌发展中的作用。 方法方法 1.采用 0.4m 孔径的 Tranwell 小室进行 CAFs 或者 NFs 与卵巢癌细胞 CAOV3体外共培养，用 RT-PCR 的方法检测共培养之后的卵巢癌
14、细胞 CAOV3 中增殖细胞核抗原（PCNA）表达的改变，以了解卵巢癌细胞增殖的变化；2.用流式细胞仪检测共培养之后 CAOV3 细胞的细胞周期和 Annexin V-FITC/PI 检测 CAOV3 细胞的凋亡情况； 3.用8m孔径的Transwell小室建立卵巢癌CAFs与CAOV3细胞的交互作用模型，观测 CAFs 对 CAOV3 细胞迁移特性的影响；4.以 Matrigel 模拟重建基底膜，用 8m孔径的 Transwell 小室建立卵巢癌 CAFs 与 CAOV3 细胞的交互作用模型，观测 CAFs对 CAOV3 细胞侵袭特性的影响。 结果结果 1.与 CAFs 共培养之后卵巢癌细胞
15、 CAOV3 的 PCNA 基因表达显著增高，并且随着 CAFs 细胞量的增加， CAOV3 细胞增殖活性显著增强。 同时 CAFs 细胞的 PCNA华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 基因表达下降，随着 CAOV3 细胞数量的增加，PCNA 表达明显减少；2.采用流式细胞仪检测细胞周期的方法可以发现，与 CAFs 共培养之后 CAOV3 细胞的凋亡显著减少，而在与 NFs 共培养之后的 CAOV3 细胞中未发现这一现象；3.同时用 Annexin V-FITC/PI的方法， 用流式细胞仪进行检测， 也可以证实与与CAFs 共培养之
16、后CAOV3细胞的凋亡显著减少，而与 NFs 共培养之后，CAOV3 的凋亡没有明显变化；4.与对照组相比 CAFs 或者 NFs 对 CAOV3 作用 8 小时后，CAOV3 迁移明显增加，但 CAFs组的增加有极显著性（P0.01） ；5.侵袭实验中发现，与对照组相比 CAFs 或者 NFs对 CAOV3 作用 24 小时后， CAOV3 侵袭明显增加， 但 CAFs 组的增加有极显著性 （P0.01） 。 结论结论 CAFs 能促进卵巢癌 CAOV3 细胞的增殖，减少其凋亡，并且两种成纤维细胞对卵巢癌细胞均有促迁移和侵袭的作用，但是 CAFs 的作用更加显著。这些发现提示我们，在 CAFs 与卵巢癌 CAOV3 细胞的交互作用中，能够促进卵巢癌的进展。 关键词关键词 卵巢肿瘤；卵巢癌 CAFs；Transwell；体外间接共培养；增殖；凋亡；迁移；侵袭 第三部分第三部分 卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞卵巢
