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1、徐州医学院硕士学位论文E-Cadherin、P16、cyclinD1在胰腺内分泌肿瘤中的意义姓名：王凤明申请学位级别：硕士专业：外科学（普外）指导教师：任泽强;李向农20050301徐州医掌腕普通外科坝l i J 究生学位论文E C a d h e r i n 、P 1 6 、c y c l i n D l 在胰腺内分泌肿瘤中的意义研究生：王风明导师：任泽强李向农中文摘要目的：探讨胰腺内分泌肿瘤( p a n c r e a t i ce n d o c r i n et u m o r s ，P E T s ) 中E 一钙粘蛋白( E c a d h e r i n ) 、p 1 6 ，细胞
2、周期蛋白D 1 ( c y c l i n D l 蛋白) 的表达及意义，并探讨其在胰腺内分泌肿瘤发病机制中的作用。方法：他用免疫组织化学S - P 法检测E - c a d h e r i n ，p 1 6 ，c y c l i n D l 蛋白，在1 3 例F 常胰腺组织及1 8 例P E T s 患者中的表达情况。将各指标表达情况与I 临床资料比较分析，相关指标问进行相关性分析。结果：1E 一钙粘蛋白在胰岛细胞瘤中的阳性表达率为6 6 6 7 ，在正常胰岛组织中表达率为1 0 0 。二者比较有显著性差异( p 5 0 为4 。l 级2 级为( 一) ，3 级4 级为( + ) 。6 统计
3、学处理方法结果以s p s s l 2 0 统计软件包处理。P E T s 各组之间指标比较及采用秩和检验。F常组和P E T s 组指标之间阳性宰分析采用配对四格表分析。P E T s 组内相关指标之间采用直线相关分析并对相关系数进行假设检验。检验水平按a = O 0 5 及a =0 0 1 判定。徐l 医学院普通外科i 畎m 卧究生学位论史实验结果lE c a d h e r i n ，p 1 6 ，c y c l i n D l 蛋白在P E T s 及j E 常胰腺组织的表达情况在P E T s 病例组中，1 8 名病例E - c a d h e r i n ，p 1 6 ，c y c
4、 l i n D l 蛋白染色情况见表。其中两种标志物阴性，种标志物阳性的有9 例。占5 0 。一种标志物阴性，两种标志物阳性的病例有4 例。占2 2 。三种标志物均为阳性的病例有5 例。占2 8 ；E - c a d h e r i n ，p 1 6 ，c y c l i n D l 分布在肿瘤不同部位呈弥漫或局灶状分布。( 见表1 )2E c a d h e r i n ，p 1 6 ，c y c l i n D l 蛋白在P E T s , R i E 常胰岛组织的表达情况相关分析21E c a d h e r i n 蛋白在P E T s 及正常胰岛组织的表达情况相关分析。E c a
5、d h e r i n 在对照组1 3 例_ j ：F 常正常胰岛组织中均呈阳性表达，表现为细胞细胞交界处呈黄色或棕黄色染色，或围绕细胞膜呈线性较强棕黄色染色，在P E T s中，染色呈多种形态，部分表现为细胞膜周围的正常阳性染色，部分表现为细胞质染色或以细胞质为主的混合性染色以及完全阴性染色( 见图1 4 ) 。E c a d h e r i n蛋白在正常胰岛组织表达率为1 0 0 。在P E T s 中阳性率为6 6 6 7 。差异有显著性( p 00 5 00 5I 岱性311O04lO02303正常胰岛肿瘤组徐州医学院普通外科硕士研究生学位论文表4功能性和无功能性胰岛细胞瘤三种指标表达
6、情况钙粘蛋自0 1 6c y c l i n D ll 级2 级3级4级P1 级2 级3 级4 级Pl 级2 级3 级4级P无 助O15l能 00 5321O2 00 5 00 5有 功4133+ l63 。10380能1 4徐州医学院普通外科硕士研究生学位论文讨论胰腺内分泌肿瘤是临床上具有特色的肿瘤，在光镜下肿瘤细胞和正常胰岛细胞很相似，核分裂象罕见。电镜下有些良性肿瘤可以见到与之相应的正常胰岛细胞类似的特征性分泌颗粒，这有助于判定肿瘤细胞类型。但大多数胰腺内分泌肿瘤，特别是恶性胰腺内分泌肿瘤只含有不典型分泌颗粒，很难识别其类型，电镜及光镜在鉴别胰腺内分泌肿瘤的类型及良恶性上无明显意义。目前
7、，分子生物学研究认为肿瘤是基因的疾病，是染色体上D N A 损伤致使基因突变的结果。它的发生是一个多阶段多因素的过程，涉及到癌基因，抑癌基因，细胞周期失去正常调控，黏附分子，肿瘤血管形成，细胞凋亡等方面。最后细胞生长失控，缺乏分化，而异常增生，并可侵犯正常组织和器官，并散布全身。基因行使着调节细胞生长与分裂的功能。基因主要分为原癌基因与抑癌基因两大类。在人类恶性肿瘤发生发展过程中，基因的遗传性获得性的改变是决定性的步骤，真核细胞的分裂周期遵循G 1 S G 2 - M 期的顺序。细胞一旦从G l 期进入S 期则不再依赖外界信息刺激而很快完成分裂过程。G 1 晚期R 点可以决定细胞进入S 期继续
8、增殖还是进入G O 期或离开细胞周期进入终末分化或死亡。不同的细胞周期素( c y c l i n s ) 和细胞周期素依赖激酶( C D K s ) 对R 点进行调节。目前文献认为c y c l i n D l 最为重要。当C D K s 与c y e l i n D l 结合并被磷酸化后激活，使R b 蛋白磷酸化。后者释放E 一2 F 因子引起基因转录。由抑癌基因P 1 6 编码的蛋白可以与c y c l i n D l 竞争C D K s , 抑制R b 蛋白磷酸化，打断基因转录。如果C D K s的活性得不到合理抑制，细胞就会不断增殖，引起肿瘤的发生【1 3 1 。1P 1 6 蛋白、
9、c y c l i n D l 蛋白，E - 钙粘蛋白临床意义及在胰腺内分泌肿瘤中意义分析1 1P 1 6 蛋白临床意义及在胰腺内分泌肿瘤中意义分析抑癌基因P 1 6 定位于9 p 2 1 ，它的完整序列包括两个内合子和三个外显子，编码分子量为1 6 0 0 0 的蛋白质。在细胞周期中P 1 6 既是固有的调节者，又是抑制肿瘤生长的关键成分。当P 1 6 缺失或突变时，一方面不能与c y c l i n D l 竞争同C D K 4的结合，阻止细胞分裂。另一方面，增加c y e l i n D l 同C D K 4 的结合，进一步刺徐州医学院普通外科硕士研究生学位论文激细胞分裂，从而使细胞生长
10、失控向癌变发展【l 。研究表明，在多种恶性肿瘤中细胞有明显的P 1 6 蛋白表达缺失【1 6 1 。P 1 6 在遗传学上明显改变见可于恶性胶质瘤，黑色素瘤，白血病，胰腺癌，食管癌，卵巢癌，膀胱癌等【1 7 I房学东等对恶性胰腺内分泌肿瘤进行P 1 6 蛋白表达量进行检测，结果恶性肿瘤该蛋白的表达率明显低于正常胰岛组织；提示恶性胰腺内分泌肿瘤发展中存在P 1 6 基因突变。M u s c a r e l l a P 1 明等报道9 1 7 的标本中表现为P 1 6 功能使活性改变。本文研究结果显示在正常胰岛及肿瘤组织间P 1 6 的表达有显著性差异。，良性与恶性胰腺内分泌肿瘤间表达水平无差异。
11、提示P 1 6 的失活使胰岛细胞R 点负调控缺失，细胞易于通过R 点进入增值状态，并且允许复制未经修复的突变D N A ，积累肿瘤表现型基因改变，在其他因素联合作用下细胞瘤变。但良性与恶性胰腺内分泌肿瘤间表达水平无差异，提示P 1 6 的失活可能与P E T 的恶性转化无关，而仅在G 1 s 期时发挥作用，促进细胞的增殖，是P E T s 发生中早期事件。功能性胰岛细胞瘤与无功能性胰岛细胞瘤之间表达水平无差异提示P 1 6 的失活不是造成无功能性胰岛细胞瘤恶性率高于功能性胰岛细胞瘤因素，或许联合其他因素共同分析更有意义。另外也可能与样本例数偏少有关。1 2c y c l i n D l 蛋白临
12、床意义及在胰岛细胞瘤中意义分析c y c l i n D l 基因定位于染色体1 1 q 1 3 ，编码2 9 5 个氨基酸的蛋白质，分子量为3 4 0 0 0 。该基因在细胞分裂的G l 期合成，控制细胞由G 1 期进入s 期。是G l 期细胞增殖信号的关键蛋白，过度表达使G l 期缩短而提前通过R 点进入s 期，使细胞增值失控，最终形成肿瘤 2 0 1 。近年对其研究发现，其不但于肿瘤的发生，发展，相关，而且与肿瘤的侵润转移，预后密切相关。在多种肿瘤中发现c y c l i n D l蛋白过表达者生存率明显低于低表达者。提示其可以作为有效的预后因子【2 1 1 1 2 2 。因此，许多作者
13、将此蛋白视为一种癌基因，认为其过度表达最终形成肿瘤【2 如。K h o o 等发现在转移性甲状腺癌患者中，c y c l i n D l 蛋白表达水平明显高于未发生转移者【2 们。但S c h w a n d e r 通过对直肠癌的研究认为c y c l i n D l 蛋白与临床预后无明显相关性 2 5 】。Y u 等对正常组织与胃癌组织c y c l i n D l 蛋白表达研究表N - 组之间无明显差异。过量表达的c y c l i n D l 蛋白与病理变化无任何级联【2 6 1 。徐州医学院普通外科硕士研究生学位论文在本研究中，7 2 2 2 的P E T s 中显示有c y c l
14、 i n D l 蛋白过量表达，说明其在P E T s 发生过程中发挥一定作用，但在良恶性肿瘤间无统计学意义。提示c y c l i n D l蛋白过表达也可能是P E T s 发生中早期事件。这与C h u n g 等研究结果【2 7 】基本一致。c y c l i n D l 蛋白过表达增强了细胞通过R 点正向作用，产生与P 1 6 的失活同样后果。C y c l i n D l 在胰腺内分泌肿瘤中的过表达显示其在肿瘤发生中起着重要作用其过表达的原因有多种机制参与，除了D N A 增殖或错意突变外是否是由于起始区的突变或调节转录因子的突变尚不清楚，另外转录后调控对于C y c l i n
15、D l 的过表达亦有重要作用，不管机制如何C y c l i n D l 过表达在肿瘤发生中具有重要意。c y c l i n D l 蛋白在功能性胰岛细胞瘤与无功能性胰岛细胞瘤之间表达水平无差异，提示C y c l i n D l 的过表达也不是造成无功能性胰岛细胞瘤恶性率高于功能性胰岛细胞瘤因素。B c l - 2 是一种抗凋亡基因，能够抑制多种因素引起的细胞凋亡。在对B c l 2 和C y c l i n D l 研究中，发现B c l 2 在人类乳腺癌M C F l 0 A 细胞的表达可诱导C y c l i n D l表达。在外源性B c l 一2 转染缨胞中，发现C y c l
16、i n D l 的表达增加与其启动子活性密切相关。在人类乳腺癌M C F l 0 A 、B T 5 4 9 和M C F7 细胞株中均发现B c l 2 对C y c l i n D l 启动子活性具有诱导作用，表明B c l 2 具有诱导C y c l i n D l 的潜在癌基因活性【2 8 】。在胰腺内分泌肿瘤的发生过程中B c l 2 的抗凋亡作用是否对也对C y c l i n D l 启动子活性进行激活诱导目前未见详细报道。还有待实验结果的支持。1 3E 钙粘蛋白临床意义及在胰腺内分泌肿瘤中意义分析E - 钙粘蛋白是I 型钙粘蛋白超家族的跨膜糖蛋白分子。为一种重要细胞粘附分子和信号转导分子。介导同种细胞问的粘附。其与肿瘤的发生和发展转移关系密切。目前，E 钙粘蛋白作为癌细胞转移抑制分子已经得到确认。B y e r s 在体外实验中发现：相当于E 钙粘蛋白阳性细胞而言，E 钙粘蛋白阴性的细胞更易在较低的剪应力下脱离原瘸灶，而这种剪
