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1、B 2 3 应用基因芯片技术检测多囊卵巢综合征患者种植期子宫内膜的差异表达基因北京大学第三医院生殖医学中心( 1 0 0 0 8 3 )王丽娜乔杰P C O S 是生育年龄妇女常见的一种复杂的内分泌及代谓 异常疾病，以雄激素过多及长期无排卵为特征。P C O S 患者经促排卵治疗后，有卵泡发育及排卵，但妊娠结局仍不尽如人意，那么是否在胚胎种植水平上存在问题? 先前关于P C O S 子宫内膜容受性也进行了一些研究，但受研究手段的限制，多是研究一个或几个因子对子宫内膜容受性的作用，存在片面性和局限性，不能得到一致认同。基因芯片技术的发展使在基因组范围内研究子宫内膜容受过群成为可能，从而可以高通量
2、地研究所有与最终生物学表型相关联的基因表达变化，以期寻找在内膜容受性过拌中发挥关键作用的基因。本研究对P c o s 患者种植窗口期子宫内膜及正常对照组种植窗口期子宫内膜的全基因组进行检测，寻找P C O S 与正常对照相比，子宫内膜的差异表达基因，以期发现P C O S 患者子宫内膜容受性变化的机制，探讨这些变化与胚胎种植的可能关系。材料和方法1 病例选择( 1 ) 人选标准P C O S 患者及正常对照组均无高血压、糖尿病等遗传病家族史，也无其他内科合并症及并发症；所有入选者超声检查均无生殖器异常发现，全身体格检查无异常发现，临床证实未妊娠，不合并子宫内膜异位症及其他系统疾病；正常对照及P
3、 C O S 组人选患者均签署知情同意书。正常对照组：选择因男方因素不孕就诊于北京大学第三临床医院生殖中心的非P C O S 患者7 例( 超声无P C O 征，平素月经规则，无多毛和或痤疮或脂溢性皮肤，血清雄激素水平在正常范围内) 。P C O S 组：选择就诊的P C O S 患者9 例，其中6 例为因输卵管梗阻或男方因素行体外受精，促排卵治疗后发生卵巢过度刺激综合征( o v a r i a nh y p e r s t i m u l a t e ds y n d r o m e ，O H S S ) 者。3 例为自然周期监测排卵，发生卵泡黄索化不破裂( 1 u t e i n i z
4、 e du n r u p t u r c df o l l i c l e ，L U F ) 者。( 2 ) 控制性超促排卵方案及取卵数P C O S 发生O H S S 的6 例患者，均为阿拉瑞林短方案，阿拉瑞林1 5 0 u g ，月经第二天起始，果纳芬2支或果纳芬3 支，月经第三天开始，应用c n 总量：果纳芬1 9 支，h M G I O 3 支。平均取卵3 2 7 枚。2 取材方法及标本处理( 1 ) 基因芯片实验标本所有患者均知情同意后行阴道超声监测卵泡发育，分为正常对照组及P C O S 组。正常对照组7 例患者均为自然周期，于月经周期第8 大开始行阴道超声监测排卵，于排卵后6
5、 天取子宫内膜。P C O S 组中3 例为因输卵管因素行F 一盯，发生中一重度卵巢过度刺激综合征( o v a r i a nh y p e r s t i m u l a t i o ns y n d r o m e ，O I t S S ) 未移植胚胎者，于取卵后6 天取子宫内膜；3 例为自然周期监测排卵，发生卵泡未破裂黄素化( 1 u t e i n i z e du n m p t u r e df o l l i c l e 。L U F ) 者，阴道超声观察卵泡形态特征，结合宫颈黏液评分及血L H 、B 、P水平测定，于确定L U F 日起6 天取子宫内膜。( 2 ) 验证实验标
6、本一F E T 治疗过程中囚发生O H S S 不能行胚胎移植的P C O S 患者3 例( 其中男方因素2 例，输卵管因素1 例) ，于取卵后6 天取子宫内膜。( 3 ) 取材方法患者取膀胱截石位，常规消毒，于无菌条件下采取子宫内膜，部分标本进行组织病理学检查。部分一l J 6 一标本以生理盐水漂洗，洗去其中混杂的血液后迅速转移至液氮中保存备用。所有标本均经患者同意用于科学研究，并经北京大学医学部病理教研室专人阅片，符合分泌中期子宫内膜表现。3 诊断标准P C O S 诊断按新的K S I - I R E A S R M 标准，根据G o l a n 等对卵巢过度刺激综合征的分度分为分为轻、
7、中、重度；根据超声声像学特点结合宫颈黏液评分及血清L H 、E 2 、P 水平诊断L U F 。4 实验方法( 1 ) 基因芯片实验方法：提取R N A ，合成e D N A 并纯化，寡核苗酸芯片及实验操作方法由博奥公司提供。( 2 ) R e a lt i m eP C R 实验方法：提取R N A ，合成e D N A 并纯化，根据M x3 0 0 5 P T MR e a lT i m eP C RS y s t e r n指导操作手册，使用B r i l l i a n t * S Y B R “ G r e e nQ i - C R 试剂盒进行R e a lt i m eP C R
8、，用溶解曲线来监测产物中是否有引物二聚体的产生，2 琼脂糖凝胶电泳进一步确认P C R 产物扩增片段。相对表达率根据P f a f l l方法计算，以肌动蛋白p ( 1 3 一A c t i n ，A C T B ) 作为内参照，计算基因相对表达率( R a t i o 值) 。结果I 两组间一般条件比较P C O S 组平均年龄3 1 6 7 2 0 6 岁；正常对照组平均年龄2 8 5 8 4 5 4 岁；两组相比，P ) 0 0 5 。P C O S 组体重指数( B M I ) 2 2 8 3 1 4 7 ；正常对照组B M I 为2 2 4 34 - 2 0 7 ；两组相比P O 0
9、 5 。P C O S 组原发不孕3 例，继发不孕3 例；正常对照组原发不孕4 例，继发不孕3 例；两组相比P O 0 5 。P C O s 组不孕时间6 1 7 4 - 1 3 3 年；正常对照组不孕时间5 4 3 3 3 1 年，两组相比P O 0 5 。两组基础状态下的血清P R L 、E 2 值和血压位均在正常范围，具有可比性。2 基囚芯片结果分析整理杂交图片背景均一，无污染，图像清晰，表达基因约占全基因组数的4 0 左右，符合已知表达模式规律。全片杂交点图像规则，大小均一。荧光交换结果显示芯片重复性好，R 2 = O 9 6 ，提示生物样本重复的芯片间具有可比性。基因芯片的杂交信号扫
10、描结果显示：在我们的全基因组芯片中，所有表达基因为9 4 2 1 条，占4 3 6 7 ( 9 4 2 1 2 1 5 7 1 条) 差异基因占表达基因的比例为1 2 3 ( 1 1 6 9 4 2 1 条) 。P c o s患者与正常对照相比明显上调的基因( 比值2 ) 占0 1 1 4 ( 1 1 9 4 2 1 条) ，明显正调的基因( 比值0 5 ) 占1 1 1 ( 1 0 5 9 4 2 1 条) 。3 P C O S 患者与正常对照相比差异表达基因分类在g e n eo n t o l o g y 数据库中检索我们所得到的差异表达基因，人致分为三类：与细胞成分相关的基因占3 2
11、9 2 ，与细胞分子功能相关的基因3 5 8 3 ，与生物学过程相关的基因占3 1 2 5 。在P C O S 患者子宫内膜基因芯片检查结果中发现一些与细胞膜整合、黏附及侵袭性生长、细胞骨架相关基因的差异表达，见表I 。表1P C 0 6 患者与膜整合、黏附及侵袭性生长、细胞骨架相差的下调差异表达基因一1 1 7 续表14 验证实验结果R e a l t i m eP C R 结果显示。P C O S 患者子宫内膜T M 4 S F 4 及M M P 2 6 表达均明显下调，其中T M 4 S F 4 下调9 1 倍，M M P 2 6 下调7 6 倍，与芯片结果相符，见表2 。表2 与正常对
12、照组相比P C O S 患者着床窗口期子宫内膜T M 4 S F 4 殛M M P 2 6 的表达讨论子宫内膜容受性的研究一直足生殖医学领域研究的热点和难点。既往研究虽发现许多与粘附、细胞骨架相关的因子与子宫内膜容受性相关，但截止目前，尚没有可被临床应用的子宫内膜容受性标志物。一1 1 8 一我们对P c o S 进行全基因组芯片研究发现，与细胞膜整合、黏附及侵袭性生长、细胞骨架相关基因的变化占较大比例，共有2 9 个相关基因表达下调。这些基因有的为先前即已经研究过的与子宫内膜容受性相关基因( 如：连环蛋白a 2 ，p l a k o p h i l i n2 ，L i p o p h i l
13、 i nB ，M a m m a g l o b i n1 ，整合素胆等) ，有的为新发现 与子宫内膜容受性相关基因( 如；E N T P D 3 及S O R D ) 。在这2 9 个下凋基因中，最引人注目的是跨膜4 超家族成员4 ( T r a n s m e m b r a n e4s u p e r f a m i l ym e l l l b e r4 。T M 4 S F 4 ) ，下调为1 1 6 5 。研究发现，该基因位于细胞膜上，编码跨膜货白质，参与细胞间粘附的调节。T a k a o k a 等在对结肠癌的研究中发现，T M 4 S F 4 基冈表达并不影响肿瘤细胞的体外生
14、长，但可提高非钙依赖的细胞凝聚能力，抑制细胞的运动能力和侵袭能力，使细胞对纤粘连蛋白的结合力及细胞的迁移能力下降。R i e s e w i j k 等在对人黄体中期对比黄体早期子宫内膜的研究中也发现该基因表达上调。另外“u 等发现该基因在细胞增殖及肝再生方面起作用。在P c O s 患者子宫内膜芯片中此基因的显著下调，可能与粘附能力减弱有关，提示可能与P C O S 患者下降的子宫内膜容受性相关。R e a lt i m eP C R 实验也证实在P C O S 患者种植窗1 3 期子宫内膜存在T M 4 S F 4 表达的明显下降( 下调为W ) 。显著下调的基因还有：组织因子通道抑制剂(
15、 T i s s u e f a c t o rp a t h w a y i n h i b i t o r 2 ，P 1 2 ) ，也称P P 5 。为胎盘来源的糖蛋白，具有丝氨酸蛋白水解酶抑制剂活性，属于K u n i t z 型蛋白水解酶抑制剂家族，其w - R -N A 在妊娠的任何阶段均可检测到，特异表达于胎盘合体滋养层。C a r s o n 等通过基因芯片研究发现，与黄体早期相比，P P 5 在黄体中期表达上调；C h e o t t 等用R U 4 8 6 处理鼠胚胎种植的子宫内膜，发现处理后P P 5 表达水平下调。胚胎种植的关键步骤之一是滋养层细胞对其游走部位E C M
16、的降解。M M P s 属Z 1 1 依赖性蛋白酶类，是催化E C M 降解的主要酶类之一。现已发现一些M M P s 与胚胎种植有关，研究较多的是M M P 一9 及其抑制物T I M P 一1 。M M P 一2 6 为M M P s 家族的新成员，与M M P 一7 同属于基质溶解因子，能有效降解纤维蛋白原和纤粘连蛋白等各种E C M 。研究发现，M M P 一2 6 表达于人子宫内膜，且随月经周期不同，呈周期性变化，在分泌中期子宫内膜上皮细胞中呈现高表达。仇巍等研究发现在妊娠早期，胎盘中M M P 一2 6高表达，至妊娠中期降至最低，但在足月胎盘中其表达又有显著提高，提示M M P 一2 6 可能参与妊娠早期的滋养层细胞浸润和分娩时的胎盘剥离。在我们的芯片杂交结果中，M I L P 2 6 显著下调为倍) ，R e a lt i m eP C R 实验也证实M M P 2 6 住P C O S 种植窗口期子宫内膜的表达较正常
