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1、兔抗内皮细胞抗体（AECA）酶联免疫分析试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA 法定量测定兔血清、血浆或其它相关液体中抗内皮细胞抗体（AECA）含量。 实验原理抗内皮细胞抗体（anti-endothelial cell antibody，AECA）被发现已有 20 余年的历史,其抗原是位于内皮细胞表面的一簇异质性蛋白， 该抗体可出现在与血管炎有关的多种自身免疫病当 中，尤其是系统性血管炎（ systemic vasculitis）和系统性红斑狼疮（ systemic lupuserythematosus，SLE）等，为血管受损和血管炎的标记，在发病过程中与疾病的活动有很大 的
2、关系。本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中 AECA 水平。用纯化的抗体包被微孔 板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 AECA 抗原、生物素化的抗兔 AECA 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 AECA 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：一块（96 孔）标准品（冻干品） ：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置 10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，
3、其浓度为 1000 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成 1000ng/mL，500 ng/mL ，250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31 ng/mL，15.6 ng/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/mL，临用前 15 分钟内配制。 如配制 500 ng/mL 标准品：取0.5ml 1000 ng/mL 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。2. 样品稀释液：120ml/瓶。3. 检测稀释液 A：110ml/瓶。4. 检测稀释液 B：110ml/瓶。5. 检测溶
4、液 A：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液 A 1：100 稀释，稀释前根据预先 计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100ul） ，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 1ul检测溶液 A 加 99ul 检测稀释液 A 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 6. 检测溶液 B：1120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液 B1：100 稀释。稀释方法同检测 溶液 A。7. 底物溶液：110ml/瓶。 8. 浓洗涤液：130ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。9. 终止液：110ml/瓶（2N H2SO4） 。 标本的采集及保存 1血清：标本请于室温放
5、置 2 小时或 4过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测 ，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。 2血浆：可用 EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品 100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37反应 120 分钟。 2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。3. 每孔加检测
6、溶液 A 工作液 100ul，37,60 分钟。洗板 3 次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液 B 工作液 100ul，37，60 分钟，洗板 5 次，甩干。5. 依序每孔加底物溶液 90ul，37避光显色 30 分钟（此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明 显的梯度兰色，后 3-4孔梯度不明显） 。6. 依序每孔加终止溶液 50ul，终止反应（此时兰色立转黄色） 。用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD值） 。 注：1每次实验留一孔作为空白调零孔， 该孔不加任何试剂， 只是最后加底物溶液及 2NH2SO4。 测量时先用此孔调 OD 值至零。2为防止样品蒸发，试验
7、时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸 ，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.4ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的兔 AECA，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标） ，OD 值为纵坐标（普通坐标） ，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准 物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直
8、线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。 4 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 6底物请避光保存。 检测范围：15.6 ng/mL -1000 ng/mL 说明1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染， 试剂避免受到微生物的污染
9、，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵 育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20，部分试剂保存于 2-8，具体以标签上的标示为准。 4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 8. 有效期：6 个月
