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1、1石杉碱甲固体脂质纳米粒包封率的测定方法研究作者：李园，陈桐楷，林华庆，张蜀，邓红【摘要 】 目的 建立石杉碱甲固体脂质纳米粒(Hup ASLN)包封率的测定方法。方法 分别采用透析法、超滤法分离固体脂质纳米粒和游离药物,以高效液相色谱法测定石杉碱甲的含量。结果 超滤法能有效地将石杉碱甲固体脂质纳米粒与游离石杉碱甲分离，回收率为 98.09%，测得 3 批样品的平均包封率为 57.63%。结论 超滤法方便快捷，结果准确，适用于石杉碱甲固体脂质纳米粒的包封率测定。 【关键词】 石杉碱甲;固体脂质纳米粒;包封率;透析法; 超滤法Abstract:Objective To establish a m
2、ethod for the determination of the entrapment efficiency of solid lipid nanoparticles loading huperzine A (Hup ASLN). Methods The solid lipid nanoparticles and free drugs were separated by ultrafiltration and dialysis with HPLC for the assay of Hup A. Results Free drugs could be effectively separate
3、d from the Hup ASLN by ultrafiltration. The average entrapment efficiency of three batches of Hup ASLN was 57.63%,with 2the recovery of 98.09%.Conclusion It convenient,sensitive and accurate with ultrafiltration,and can be used to determine the entrapment efficiency of Hup ASLN.Key words:huperzine A
4、; solid lipid nanoparticles; entrapment efficiency; dialysis; ultrafiltration石杉碱甲(huperzine A,Hup A)是从中草药蛇足石杉 (千层塔)中分离出来的天然产物，是一种高效、可逆的胆碱酯酶抑制剂，能促进记忆再现和增强记忆保持。据文献报道，石杉碱甲治疗阿尔茨海默氏病有确切的临床疗效，是目前国际上治疗老年痴呆较为理想的候选药物1。但石杉碱甲生物半衰期短，口服或注射后会出现不良反应而影响其疗效2。近年来，固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)作为一种给药新载体，在不同给药途
5、径中具有很大的开发潜力和市场前景。将 Hup A 包封于 SLN 内，再制成经皮给药制剂，能增加药物在局部组织的积累并起到持续释药的作用，相对减少全身吸收以避免不良反应。SLN 的药物包封率是处方工艺筛选与质量评价的重要指标，也是其发挥疗效的关键。本文采用高压乳匀法制备了石杉碱甲固体脂质纳米粒(Hup ASLN)，分别用透析法、超滤法测定其包封率，并分别对这两种测定方法进行比较和方法学考察，优选出准确度高3的 Hup ASLN 包封率测定方法。1 仪器与试药Ultimate 3000 型液相色谱仪( 美国戴安公司);NS1001L 型高压均质机(意大利 Niro Soavi SPA. 公司);
6、Zetasizer 3000HS 型激光粒度仪(英国 Malvern 公司) 。石杉碱甲原料药(浙江万邦药业有限公司，批号:20090402);透析袋(截留分子量 8 00013 000，上海百博有限公司);单硬脂酸甘油酯(天津市百世化工有限公司);超滤离心管( 截留分子量 50 000， Sartorius);泊洛沙姆 188(德国 BASF 公司); 油酸(天津市大茂化学试剂厂);甲醇、乙腈为色谱纯 ;其他试剂为分析纯。2 方法与结果2.1 Hup ASLN 的制备3,4称取 1.5 g 泊洛沙姆 188，加适量蒸馏水超声分散至完全溶解，将其置于 70 恒温水浴中，作为水相;称取处方量的主
7、药与混合脂质材料(单硬脂酸甘油酯和油酸) ，主药和脂质材料比例为130(质量比 )，在恒温磁力搅拌器 70 条件下充分熔融，作为油4相。在磁力搅拌下(1 000 rmin-1)，将水相滴加到油相中，保持恒温搅拌一定时间后停止加热，并继续搅拌一定时间，得初乳。将初乳在均质压力 70 00090 000 kPa 下，通过高压均质机乳匀 4 次，即得 Hup ASLN。同法制备 3 批，置于 4 冰箱保存，备用。同法制备空白 SLN。2.2 色谱条件色谱柱：Agilent C8 柱(250 mm4.6 mm，5 m);流动相：0.02 molL-1 磷酸二氢钾(pH 值 3.90)乙腈 (体积比 8
8、614);进样量：20 L;检测波长：310 nm;流速：0.8 mLmin-1。2.3 专属性试验精密量取空白固体脂质纳米粒及含药固体脂质纳米粒各 1 mL，用体积分数 80%甲醇溶液超声破乳后定容至 50 mL 容量瓶中，离心，取上清液过滤，按上述色谱条件分别进样，结果见图 1。由图 1 可见，石杉碱甲峰与相邻峰分离良好，保留时间约为 6.3 min，辅料对药物的测定无干扰。2.4 线性关系考察5精密称取石杉碱甲对照品，用体积分数 20%的甲醇溶液溶解后配成质量浓度为 500.0 gmL-1 的储备液。分别精密移取储备液适量，用体积分数 20%甲醇稀释成质量浓度为5.0、10.0、25.0
9、、40.0 、50.0 gmL-1 的系列对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样。以峰面积 (A)对质量浓度()作线性回归，得回归方程为 A=0.794-0.1225 (r=0.999 9)，表明石杉碱甲在5.050.0 gmL-1 内线性关系良好。2.5 精密度试验取“2.4” 项下 5.0、25.0、50.0 gmL-1 的溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，于 1 d 各重复进样 5 次，计算日内精密度，结果低、中、高 3 种浓度的 RSD 分别为 0.28%、0.03% 、0.07%;连续 5 d 重复进样 5 次，计算日间精密度， RSD 分别为0.43%、0.11%、0.19%。
10、表明精密度符合方法学要求。2.6 稳定性试验精密吸取“专属性试验”项下的含药供试品溶液 20 L，分别于 0、2、4、6、8、24 h 进样，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果 RSD 为 0.56%，表明样品在 24 h 内稳定。62.7 回收率试验精密配制低、中、高 3 个浓度( 相当于 Hup A 质量浓度为400.0、500.0、600.0 gmL-1)的 Hup A 20%甲醇溶液，分别与空白 SLN 按 11 比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各 1 mL，每个浓度各 5 份，分别置 10 mL 容量瓶中，加适量体积分数 80%的甲醇溶液超声 20 min
11、后定容，然后经 3 000 rmin-1离心机离心 10 min，取上清液过滤后按“2.2”项下色谱条件进样，计算回收率，结果见表 1。2.8 Hup ASLN 中 Hup A 含量的测定精密移取 Hup ASLN 1 mL，置 50 mL 容量瓶中，加适量体积分数 80%的甲醇溶液超声 20 min 后定容，然后经 3 000 rmin-1 离心机离心 10 min，取上清液过滤后按“2.2” 项下色谱条件进样，用外标法计算样品含量。测得 3 批样品的含量分别为99.53%、99.78%、99.81%。表 1 回收率试验2.9 Hup ASLN 包封率的测定2.9.1 透析法2.9.1.1
12、透析介质的选择7透析法中透析介质一般以水为主体，因 Hup A 不溶于水，易溶于甲醇，故选择透析介质时考虑使用不同浓度的甲醇 水溶液。因甲醇对 SLN 的结构有破坏作用，故避免使用高浓度甲醇。预试验中发现 20%的甲醇 水溶液对 Hup A 有一定的溶解能力，可以满足药物游离出来的条件。且该体积分数的甲醇对 SLN 的外观与结构无明显影响，不会破坏粒子的乳化层而影响结果的准确性。故选择 20%的甲醇 水溶液作为透析介质。2.9.1.2 透析条件的确定5精密移取 Hup ASLN 1 mL,置已处理好的透析袋中，两端扎紧后作为内相，再移取 20%的甲醇 水溶液 10 mL 作为透析介质，同法做
13、8 份样品。在 25 、120 rmin-1 条件下，将样品置于摇床中，分别于 0.5、1、1.5 、2、3、4 、5、6 h 时间点各取出 1 份样品，取透析介质过滤后，按“2.2” 项下色谱条件进样，计算其中游离药物含量，结果表明在 2 h 后达到透析平衡。2.9.1.3 方法回收率试验配制低、中、高 3 个浓度( 分别相当于 Hup A 质量浓度为400.0、500.0、600.0 gmL-1)的 Hup A 20%甲醇溶液，分别与8空白 SLN 按 11 比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各 1 mL，在 25 、120 rmin-1 条件下，将其置于摇床中平衡 2 h，取透析
14、外相过滤后，测定游离药物含量，计算回收率。结果见表2。2.9.1.4 包封率的测定精密移取 Hup ASLN 1 mL，置已处理好的透析袋中，两端扎紧后作为内相，再移取 20%的甲醇 水溶液 10 mL 作为透析介质。25 、120 rmin-1 条件下，置于摇床中，透析 2 h，然后取透析介质过滤，按“2.2” 项下色谱条件测定，计算其中游离药物的量(Wf);同时精密移取 Hup ASLN 1 mL,同“2.8”项下测定 Hup ASLN 中总药物的含量，计算总药物的量(Wo) ，并计算包封率 包封率=(Wo-Wf)/Wo100%。用上述方法平行测定 3 批样品的包封率为 54.24%、52
15、.08%、53.83%，平均值为 53.38%。2.9.2 超滤法2.9.2.1 超滤离心管对 SLN 透过能力的考察取 Hup ASLN 适量置超滤离心管中离心 30 min，转速为 4 000 rmin-1，收集滤液并测定粒径。滤液中未检测到 SLN，表明9滤液中无 SLN 存在，超滤离心管能达到完全截留 SLN 的效果。2.9.2.2 方法回收率试验6配制低、中、高 3 个浓度( 相当于 Hup A 质量浓度为400.0、500.0、600.0 gmL-1)的 Hup A 20%甲醇溶液，分别与空白 SLN 按 11 比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各 2 mL 置超滤离心管中
16、离心 30 min，转速为 4 000 rmin-1，取续滤液 1 mL 置 10 mL 量瓶中，加体积分数 20%甲醇稀释定容，经0.22 m 微孔滤膜过滤后，按“2.2” 项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表 2。表 2 方法回收率实验结果2.9.2.3 包封率的测定取 Hup ASLN 适量，置超滤离心管中离心 30 min，转速为 4 000 rmin-1，取续滤液 1 mL 置 10 mL 量瓶中，加体积分数20%甲醇稀释定容，经 0.22 m 微孔滤膜过滤后，按“2.2” 项下色谱条件进样，计算其中游离药物的量(Wf); 同时移取精密 Hup ASLN 1 mL,同“2.8”项下测定 Hup ASLN 中总药物的含量，计算总药物的量(Wo)，并计算包封率包封率=(Wo-Wf)/Wo100% 。测得 3 批样
