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1、1石斛属植物遗传多样性的简单重复间系列分析【摘要】 目的研究我国石斛属植物间的亲缘关系。方法从 55个 ISSR 引物中筛选出 14 个多态性好的引物对石斛属（Dendrobium）植物基因组 DNA 进行简单重复间序列（ ISSR）分析。利用 POPGENE32 软件计算 ISSR 扩增产物的 Neis 基因多样性指数（H）和 Shannon 信息指数（I ） ，标记系统的有效等位基因数(effective number of alleles, NE)。应用 NTSYS（3.0）软件计算 Neis 遗传距离和遗传相似系数。按照非加权平均距离法(UPGMA)构建聚类关系图。结果 14 条引物共
2、扩增出 123 条带，多态性带 112 条，约占总数的 91.06%，平均每个引物扩增的 DNA带数为 8.79 条。Neis 基因多样性指数（H）为 0.351 9，Shannon 信息指数（I）为 0.528 2，有效等位基因数（NE）为1.594 5，种间的相似系数介于 0.090 90.695 7，平均为 0.377 9。结论我国石斛品种的遗传基础比较丰富，ISSR 分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统基本一致。 【关键词】 石斛； 简单重复间序列； 遗传多样性Abstract：ObjectiveTo probe the relationship among Dendrobium
3、 species (Orchidaceae). Methods14 primers with good polymorphism screened from 55 ISSR primers were 2used to conduct ISSR analysis and dimorphic data of DNA fragments were used to construct the dendrogram by UPGMA.ResultsTotally 123 bands were amplified and 112 of them were polymorphic accounting fo
4、r 91.06%. The average number of DNA bands amplified by each primer was 8.79. Neis gene diversity (H), Shannons information index (I) and effective number of alleles(NE) were 0.351 9, 0.528 2 and 1.594 5, respectively. The genetic similarity among all the tested clonal cultivars ranged from 0.090 9 t
5、o 0.695 7, averaging 0.377 9, which indicated that the genetic basis was relatively rich. ConclusionClustering results revealed that the dendrogram constructed with ISSR molecular makers was identical with the classic taxonomic system.Key words：Dendrobium; ISSR; Genetic diversity石斛（Dendrobium Sw.）是我
6、国传统贵重中药材，药用历史悠久，具有滋阴养胃、生津止渴的功效。分布于亚洲热带、亚热带地区和太平洋岛屿，我国有 74 个种和 2 个变种，主要分布于秦岭淮河以南诸省1 ，已被国家列为濒危灭绝的植物药材之一。石斛种质资源丰富，来源和学名比较混乱2 ，同属植物作石斛入药的种类复杂，不同来源的石斛在化学成分、含量及药理活性等方面3有一定差异3 ，同时人们对石斛属种质资源种的分类和演化等方面的研究较少，这都阻碍了石斛种质资源的合理挖掘利用。我们应用简单重复间序列（inter-simple sequence repeat, ISSR）标记技术对 28 种石斛进行分析，以确定它们之间的遗传差异和种间亲缘关系
7、，为石斛属植物系统学研究、种质资源的保护和利用提供科学依据与参考。1 器材与方法1.1 材料 实验所用石斛植物采自我国石斛主产区：云南、安徽、广东、贵州等省区的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命科学学院植物组织培养实验室，以便及时取材和观察（见表 1） ，实验样品经开花鉴定。1.2 仪器与试剂 PCR 仪（PTC-200, MJ Research, Inc, USA)；电泳仪（DYY-8C 型；北京六一仪器厂） ；电泳槽（DYCp-34A 型；北京六一仪器厂） ；Heraeus Stratos 离心机；Alpha2200凝胶成像系统。Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和 200 bp
8、DNA ladder（北京天根公司） ，Agarose（Promega 公司） ，CTAB（Sigma 公司） ，溴化乙锭（Fluka 公司） ，Tris-HCl（Ultra Pure） 、EDTA 和巯基乙4醇（上海生工公司） 。ISSR 引物根据加拿大哥伦比亚大学 (UBC)公布的序列，由上海生工生物技术服务有限公司合成。表 1 实验材料来源及采集地（略）1.3 方法1.3.1 总 DNA 的提取 取各样品新鲜原植物的叶片，采用CTAB 法提取基因组 DNA4 。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，用紫外分光光度计检测浓度，最后稀释标定到 10 ng/l备用。1.3.2 ISSR 分析 从 5
9、5 个引物中筛选出 14 个扩增谱带清晰且呈多态性的引物用于石斛材料的扩增（见表 2） 。PCR 反应在PTC-200 型梯度热循环仪（MJ Research）上进行，ISSR-PCR 扩增反应条件经过比较和优化确定为 25 l的 PCR 反应体系，其中包括 20 mmol/l KCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)，1.5 mmol/L MgCl2，100 mol/L dNTP，20 ng 基因组 DNA，2U Taq 聚合酶和 0.1 mol/L引物。PCR 扩增程序为 94预变性 7 min；94变性 45 s，50复性 45 s，72延伸 2 min，循环 40
10、 次，72延伸 10 min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，用 200 DNA ladder 作为分子质量标记，用 Alpha2200 凝胶成像系统观察结果并拍照记录。5表 2 ISSR 引物的多态性（略）1.3.3 数据处理 每个样品的扩增带按有或无记录， “有”赋值为 1， “无”赋值为 0。利用 POPGENE32 软件计算 ISSR 扩增产物的 Neis 基因多样性指数（H ） 5和 Shannon 信息指数（I）6 ，标记系统的有效等位基因数 (effective number of alleles, NE)。应用 NTSYS（3.0 ）软件计算品种间 Neis 遗传距离和遗传
11、相似系数7 。根据遗传距离，按照非加权平均距离法（UPGMA）构建聚类关系图。2 结果2. 1 引物筛选和遗传多样性分析 ISSR 扩增片段的大小在200 2 000 bp 之间（见图 1） 。14 个 ISSR 引物共扩增出 123 条带，其中多态性带有 112 条，多态性比率（PPB）为 91.06%。各引物检测到的 ISSR 位点数不尽相同，在 416 之间，平均每个引物可检测出 8.79 个位点（见表 2） ，平均多态性位点比率范围为66.7%100%。每个位点的有效等位基因数（Ne ）为 1.594 5，Neis 基因多样性指数（H）为 0.351 9，Shannon 信息指数（I）
12、为 0.528 2。材料间的遗传相似系数（GS）分布在 0.090 90.695 7 之间，平均相似系数为 0.377 9，以上数据表明，石斛植物具有较丰富的遗传多样性。6图 1 引物 UBC807 的 ISSR 扩增谱带（略）2. 2 聚类分析 根据 ISSR 标记计算的 Nei s 遗传距离矩阵，按 UPGMA 法构建了 28 种石斛植物间的遗传关系聚类图（见图 2） 。由图 2 可见，试验材料分为 5 个类群，第 1 类包括石斛组的铁皮石斛、金钗石斛、晶帽石斛、樱石斛、细茎石斛、线叶石斛、滇桂石斛、流苏石斛和大苞鞘石斛，以及黑毛组的黑毛石斛和翅梗石斛，而中国植物志并未对喉红石斛进行划分，
13、本实验支持喉红石斛划分在石斛组；石斛组的霍山石斛、尖刀唇石斛、束花石斛、曲茎石斛、疏花石斛和距囊组的红花石斛划分为第 2 类；石斛组兜唇石斛、肿节石斛、报春石斛、独角石斛、细叶石斛、玫瑰石斛和禾叶组的竹枝石斛划分为第 3 类；顶叶组的密花石斛和鼓槌石斛为第 4类；第 5 类是圆柱叶组的海南石斛。聚类结果显示 ISSR 分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统较一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系。3 讨论3.1 中国石斛植物资源的遗传多样性 石斛经长期的异花授粉和自然选择，其遗传背景非常复杂，某些种之间的形态特征相差甚远。中药石斛类药材基源复杂，混乱现象严重，因此研究石斛植
14、物7的遗传多样性是非常必要的。SSR 序列的进化率比大多数其他类型的 DNA 都高，容易出现高度变异，因此 ISSR 标记可检测出基因组许多位点的差异而表现出较高的多态性8 。我们用 ISSR 标记技术对 28 种石斛植物进行了基因组 DNA 多态性分析，结果显示ISSR 分子标记能确立它们之间的亲缘关系，表明我国石斛植物资源十分丰富，存在着很高的遗传多样性。图 2 基于 ISSR 数据的石斛属植物遗传分化聚类图（略）3.2 ISSR 技术在石斛属植物研究中的应用 在石斛植物形态分类方面吉占和曾把我国石斛属的 57 个种划分为 9 个组1 ，分别为剑叶组、圆柱叶组、禾叶组、心叶组、基肿石斛组、
15、草叶组、黑毛组、顶叶组、大花石斛组。 中国植物志把我国石斛属的 74 个种划分为 12 个组，分别为禾叶组、顶叶组、石斛组、心叶组、瘦轴组、叉唇组、距囊组、黑毛组、草叶组、基肿组、剑叶组、圆柱叶组。本研究在分子水平上的 ISSR 聚类结果与经典的形态分类学结果基本一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系，ISSR 检测到的仅是石斛基因组的部分位点，需积累更多的ISSR 检测位点并结合其它 DNA 分析技术对其系统分类与亲缘关系做出更科学的评价，也存在与经典分类学结论不完全吻合的地方，在阈值 0.42 处，黑毛组的黑毛石斛和翅梗石斛、距囊组的红花石斛和禾叶组的竹枝石斛分别与石斛组聚
16、为三类，还需要进一步探讨。8【参考文献】1 吉占和.中国石斛属的初步研究J. 植物分类学报,1980,18（ 4）:427.2 王德群,彭华胜. 霍山石斛的名实混乱与原植物J . 中国中药杂志,2004,29（12）:1198.3 白 音,王文全, 包英华,等. 不同产地美花石斛形态及多糖含量比较研究J. 中药材,2007,30(2):130. 4 彭 锐,宋洪元,李泉森, 等. 石斛总 DNA 的提取及鉴定J. 中国中药杂志,2003,28（12）:1129.5 Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populationsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70: 3321. 6 Lewontin R C. Apportionment of human diversityJ.
