武汉理工大学硕士学位论文摘要论文研究了采用溶剂挥发法制备的用于修复周围神经损伤的聚乳酸复合膜选用外消旋聚乳酸( P D L L A ) 作为基体材料，分别通过物理共混( 添加一定比例的壳聚糖和钙磷无机盐粉末及神经生长因子N G F ) 和表面截留改性的方法制备出具有良好降解性能和细胞亲和性的复合膜通过对复合膜制备工艺、成膜性能影响因素的研究，纯聚乳酸分别与不同含量壳聚糖( C H S ) 、1 3 - 磷酸三钙( D ．T C P ) 组成复合膜进行体外降解实验，测定降解介质的p H 值变化、复合膜质量变化，考虑降解速率与神经再生速度的匹配，优化复合材料的组成成分和比例，得出：在2 0 ℃、4 0 ％湿度下，聚乳酸分子量范围为：1 0 x 1 0 4 ～4 0 ×1 0 4 ，以乙酸乙酯为溶剂配制1 0 ％的聚乳酸溶液，采用溶剂挥发法、超声波分散粒径 高分子量纯聚乳酸的降解速度> 复合材料中聚乳酸降解速度3 , 4 ．6 体外降解膜材料的结构变化3 ．4 ．6 ．1 外观形貌观察纯P D L L A 膜最初是透明、柔软的复合膜呈淡黄色，壳聚糖和6 一T C P 颗粒均匀分散其中投入磷酸缓冲溶液中( p H = 7 ．3 8 ) 3 7 。
C 恒温降解，发现纯P D L L A 膜表面在1 个小时左右开始变白，随后几天有轻微的溶胀所有的材料都发生卷曲，这可能是因为制备材料时，膜材料的一面与玻璃表面接触，而导致膜两面结构不同造成随着降解时间的进行，纯聚乳酸膜开始变脆，而复合膜仍然很柔软，表面变粗糙，小瓶内出现絮状物具体而言：M w = l5 ．1 7 万的纯P D L L A 膜在1 个月后就已经成碎片状，复合膜的强度可维持到3 个月左右M w = 3 5 ．6 9 万的纯P D L L A 某和复合膜在3 个月内均能武汉理：【．火学硕士学位论文保证完整片状可见，分子量的大小明显影响聚合物的降解速度和强度仅通过调节聚乳酸的分子量是无法达到其所需的降解速度和强度的协调而通过小粒径无机、高分子材料的引入可以起到一定的增强作用3 ．4 ．6 ．2 显微结构观察我们选取M w = 3 5 ．6 9 万的一组膜作扫描电镜图3 ．8 体外降解不同时间段的纯聚乳酸及其复合膜材料的S E M 照片F i g u r e 3 ．8S E Mp h o t o so f p u r eP D L L Aa n dc o m p o s i t em e m b r a n e sa td i f f e r e n td e g r a d a t i o nt i m ei nv i t r o( ( p u r eP D L L Am e m b r a n e ：( a ) O M ；( b ) l M ；( c ) 3 M ．( x 2 0 0 0 ) )( P D L L A ／c H s ／1 3 ．T C P ／N G Fc o m p o s i t em e m b r a n e ：( d ) 0 M ；( e ) 1 M ；( f ) 3 M( ×2 0 0 0 ) ) ( P D L L A ／C H Sc o m p o s i t e m e m b r a n e ：( g ) l M ( x 2 0 0 ) ；( h ) 1 M ( x 3 0 0 0 ) ) )从图3 —8 看到：降解前，纯聚乳酸膜表面很平整、光滑，随着降解时间的进行，纯P D L L A 膜材料呈现均匀降解，1 个月时表面就出现部分微孔，体外降解3 个月后出现的微孔为平均直径在0 ．1 - - 0 ．2 “m 左右的N T L ，并且分布均匀( 如图3 - 8 ( ( a )武汉理工大学硕士学位论文( b ) ( c ) ) 。
由于颗粒的加入导致复合膜表面不平整，但其与基体材料的结合基本良好，有少许微裂纹复合膜材料在体外的降解表现的不是很明显，只是表面变粗糙，有少量微孔出现( 如图3 —8 ( ( d ) ( e ) ( D ) 从图3 8 ( g ) ×2 0 0 电镜可以看到，添加了C H S 的复合膜材料，其孔洞形状随C H S 颗粒形状，沿C H s 颗粒边缘开始形成不规则形状图3 ．8 ( h ) x 2 0 0 0 电镜可以看到，在体外降解1 个月时，C H S 颗粒表面开始降解3 ．5 本章小结本章实验添加一定含量的神经生长因子( N G F ) ，制各成P D L L A ／C H S ／p —T C P ／N G F 复合膜通过一系列体外降解实验，对复合膜材料的降解性能进行研究，分析材料的降解机理，并研究N G F 的加入对材料降解性能的影响1 ．通过静态水接触角和吸水率的测定对复合膜的亲／疏水性进行了评价，发现：纯P D L L A 是明显的疏水性材料，但神经生长因子N G F 的加入提高了材料的亲水性添加了C H S 、[ 3 - T C P 粉末的复合膜的亲水性也优于纯P D L L A 膜。
2 ．通过一系列体外降解实验发现：分子量的大小明显影响聚乳酸的降解速度和强度小分子量的聚乳酸降解快，但强度维持时间短由于膜材很薄，酸自催化效应比块状材料明显小些，因此其降解产生的酸性不明显一定比例p - T C P 和C H S 粉末的加入，可以适当增强膜材的强度，中和聚乳酸降解产物的酸性，使降解介质p H 值维持在中性神经生长因子N G F 的加入对材料降解过程中口H 值的变化及复合膜的质量损耗率均有一定影响3 ．聚乳酸及其降解产物的X R D 衍射曲线均是形状一致的弥散峰，说明聚乳酸降解过程中没有结晶型的低聚物产生4 ．用三角度激光散射仪测定的聚乳酸重均分子量出现了明显的双峰结构本实验认为：该双峰分布结构是由于聚乳酸材料内外表面的不均匀降解产生的武汉理工大学硕士学位论文第四章复合材料修复大鼠坐骨神经缺损的动物实验研究已有研究[ 6 1 - 6 2 ] 表明：在周围神经损伤局部应用外源性神经生长因子可促进神经再生在董红让等进行的复合型神经导管修复周围神经缺损的初步实验研究中[ 6 3 1 ，已经证明复合型神经导管有良好的组织相容性，能够有效促进周围神经再生，效果接近自体神经移植另外，也有研究【4 0 J 表明，非管状结构也可以修复神经缺损。
因此，在本实验中，一方面，我们尝试研究在神经缺损的局部放置含神经生长因子( N G F ) 的膜状材料是否也能促进神经再生另一方面，我们将研究不同组成的复合膜在动物体内的降解情况，并与体外降解实验的结果进行比较，探讨体外降解实验对临床研究的指导作用该动物实验是我们与广州军区武汉总医院合作进行的实验采用大鼠坐骨神经缺损模型，具体如下：4 ．1P D L L A ／N G F 复合膜的体内修复缺损神经实验4 ．1 ．1 动物和分组W i s t a r 大白鼠1 6 只，雌性、体重1 8 0 ．2 0 0 9 ，随机分为A 组( 自体神经移植)和B 组( 自体神经移植并局部放置P D L L A ／N G F 复合膜) 2 组，每组8 只4 ．1 ．2 材料和实验方法1 ．材料：P D L L A J N G F 复合膜：溶剂挥发法制备，膜厚0 ．1 5 m m ，膜大小为：1 0 m m x 9 m m ／片，N G F 含量为4 5 0 U ／片1 5 卦Y 射线照射灭菌N G F 冻干粉( 武汉海特生物制药公司产品，批号国药试字2 0 0 2 0 1 1 7 )纯P D L L A 膜：溶剂挥发法制备，技术参数与上述复合膜完全相同。
2 ．实验方法4 5武汉理工大学硕士学位论文每只动物麻醉( O ．8 ％戊巴比妥钠溶液腹腔内注射，4 0 m g ／k g 体重) 后，按无菌手术操作原则，在手术显微镜下显露右侧坐骨神经A 组将坐骨神经切除1 0 m m 一段以外膜缝合法行原位移植B 组以同样方法行神经原位移植，并在远、近二个神经缝接部位各松松包绕一块P D L L A ／N G F 复合膜，并与神经外膜缝合固定将1 0 m m x 9 m m 大小一块复合膜( 含N G F 4 5 0 u ) 的2 ／3 ( 1 0 m m x 6 m m ) 包绕在近侧缝接部位，1 ／3 ( 1 0 m m ×3 m m ) 包绕在远侧缝接部位移植神经的中段裸露，并无复合膜包绕术后6 个月，对两组神经再生情况进行检测并作对比4 ．1 ．3 检测方法和指标l 、电生理检测测定运动神经传导速度动物麻醉后，显露右侧坐骨神经，用丹麦产4 0 0 0型诱发电位／肌电图仪测定运动神经传导速度刺激电极置于神经近侧缝接部位的近侧，记录电极置于小腿三头肌2 、小腿三头肌秤重计算小腿三头肌湿重恢复率完整取下二侧后肢的小腿三头肌，用天平分别称重小腿三头肌湿重恢复率= 实验侧小腿三头肌重量／健侧小腿三头肌重量。
3 、组织学检测显露右侧坐骨神经后首先观察移植神经与周围组织粘连情况在移植段神经的中段取5 m m 长一段，4 ％戊二醛固定2 4 小时以上，1 ％锇酸后固定，环氧树脂定向包埋，半薄切片( O ．5 l u m ) ，亚甲基兰多色染液染色，光镜观察采用I { 】，L A S ．1 0 0 0 高清晰度彩色病理图文报告分析系统，测定有髓神经纤维的数量、直径、轴突直径、髓鞘厚度4 、统计学处理A 、B 两组的测定数据采用S P S S l 0 ．0 统计软件处理，用均数比较的方差分析法作统计学比较，( c 【= 0 ．0 5 ) 4 ．1 ．4 检测结果1 ．运动神经传导速度武汉理工大学硕士学位论文表4 ．1 术后6 个月运动神经传导速度( r r d s )F i g u r e 4 —1n e r v ec o n d u c tv e l o c i t ya f t e r6m o n t h s ’o p e r a t i o n组别运动神经传导速度( m ．／s )A2 0 ．7 7 土1 ．0 6B2 2 ．1 2 4 - 0 ．8 3 “注：△表示与A 组比较P 0 ．0 5术后6 月，光镜观察显示，神经移植并包绕含N G F 复合膜组，有髓神经纤维数目较多，大小、分布均匀，髓鞘厚，成熟良好；而神经移植组中有髓神经纤维大小不均，神经排雷紊乱，血管和纤维结缔组织多，如图4 - 1 和4 —2 所示。
武汉理T 大学硕士学位论文图4 —1 神经移植组，亚甲基兰多色图4 —2 神经移植并包绕含N G F 复合膜组染液染色x 4 0 0亚甲基兰多色染液染色x 4 0 04 5 讨论本实验设计大鼠自体神经移植( A 组) 和自体神经移植的同时在神经缝接部位包绕P D L L A ／N G F 复合膜( B 组) 两种不同方法处理6 个月后对比这两种不同方法处理的神经再生情况结果显示B 组的神经传导速度、小腿三头肌湿重恢复率、再生的有髓神经纤维数量、直径、轴突直径均优于A 组本实验结果表明在行自体神经移植时于局部放置P D L L A ／N G F 复合膜可促进神经再生在局部放置P D L L A ／N G F 复合膜的方法上，我们将该复合膜的大部份包绕在近侧缝接部位而小部份包绕在远侧缝接部位神经移植段的中部裸露与神经移植床接触如此处理可使( 1 ) N G F 在局部更好发挥作用：神经移植后，早期移植神经尚未与受植神经的近端建立联系，近端神经轴突尚未进入移植神经，局部放置的N G F 主要是通过与受植神经近端受体结合而发挥作用，此时将复合膜的大部份放置在近侧缝接部位可更好发挥N G F 的作用；( 2 ) 避免神经缝接部位粘连而不妨碍移植神经与移植床建立血供。
4 ．2 复合膜的体内降解实验4 ．2 ．1 材料和实验方法：将已制备好的基材分子量分别为①M w = t 5 ．1 7 万：②M w = 3 5 ．6 9 万的各种聚乳酸复合膜：纯P D L L A 、P D L L A ／N 。