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1、梅 素 容华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所环境与健康教育部重点实验室复杂样品预处理技术的研究进展个人简介1991.9-1995.7 四川大学环境系环境监测专业 本科 1995.9-1998.7 武汉大学化学系分析化学专业 硕士 1998.9-2001.7 武汉大学化学系分析化学专业 博士 2001.8-2003.9 华中科技大学环境学院 工作 2003.9-2005.10 华中科技大学公共卫生学院 博士后 2005.11-至 今 华中科技大学公共卫生学院 工作 2008.12-2009.5 德国慕尼黑大学临床化学研究所 访问学 者 2010.4-2010.11 韩国昌原国立大学
2、化学系 访问学者背 景n为了探讨环境因素对健康的影响，需要从个体暴露、个体效应和 人群效应等多个角度，深入分析环境与健康之间的关系。（队列 研究）n个体暴露主要检测复杂的环境和食品样品中低浓度污染物。n个体效应主要检测外来污染物进入人体后在体内的分布和代谢水 平。n人群效应主要检测大量人群样本中相应的生物标记物和代谢标记 物，可以准确评价个体暴露、群体暴露、个体和群体效应，因此 特别适合环境污染物对人体健康危害的综合评价。 n样品前处理技术简介n固相萃取技术n固相微萃取技术n液相微萃取n超临界流体萃取n微波萃取n加速溶剂萃取n本课题组相关的代表性研究工作提 纲n复杂样品前处理在样品分析中的地位
3、n样品前处理的目的n样品前处理的评价准则n经典的样品前处理技术样品前处理技术简介复杂样品前处理在样品分析中的地位n样品分析流程：采样（6.0） 样品前处理（61.0） 分析测试（6.0） 数据处理及整理报告（27.0） 样品前处理的目的n提高测试精度n提高方法的选择性n使样品易保存和运输n延长测试仪器的使用寿命n。检测痕量组分复杂的体系样品预处理新技术与方法的探索与研究已成为当代分析 化学以及相关交叉学科的重要课题与发展方向之一。不能检测浓缩痕量的 被测组分将待测组分与 母体或基体分离衍生化主要的作用是 富集和净化样品前处理的评价准则n是否能最大限度地除去影响测定的干扰物；n被测组分的回收率是
4、否高；n操作是否简便、省时；n成本是否低廉；n对人体及环境是否产生影响。经典的样品前处理技术液液萃取蒸 馏索氏萃取沉 淀离 心大量使用有机溶剂处理时间长操作步骤多较大误差 影响操作人员健康 污染周围环境 基本原理：与液相色谱（HPLC）分离过程相仿，是一种吸附 萃取，主要适用于液体样品的处理。当试样通过装有合适的 固定相时，被测组分由于与固定相作用力较强被吸附留在柱 上，并因吸附作用力的不同而彼此分离，样品基质及其他成 分与固定相作用力较弱而随水流出萃取柱。分类：反相SPE、正相SPE和离子交换SPE 与HPLC不同之处有：1.填料粒径（40m)要比HPLC填料（310 m ）大；2.柱效低，
5、通常只有1050塔板。固相萃取（solid-phase extraction, SPE）SPE的优点(1) 简单、快速和简化了样品预处理操作步骤,缩短了预处理时间。(2) 处理过的样品易于贮藏、运输,便于实验室间进行质控。(3) 可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂处理各种不同类的有机污 染物。(4) 不出现乳化现象,提高了分离效率。(5) 仅用少量的有机溶剂,降低了成本。(6) 易于与其他仪器联用,实现自动化在线分析。SPE装置SPESPE的的基本步骤基本步骤举例：反相萃取柱C18, C8, Phenyl, CN, NH2活化：甲醇、乙腈等，1倍柱管体积或3倍 柱床体积3-5 mL/min平衡：
6、水，1倍柱管体积或3倍柱床体积,3 -5 mL/min上样：水溶液（缓冲剂稀释）生物流体等 ,1mL/min淋洗：含5-50%极性有机溶剂的缓冲水溶 液，1-2倍柱管体积或5-10倍柱床体积 ，1-2 mL/min洗脱：极性或非极性有机溶剂，可选加水 、缓冲剂、酸、碱等调节剂；2-4倍柱 床体积。上样：流出与吸附剂作 用最弱的杂质；极性最 强淋洗：流出与吸 附剂作用比目标 物弱的杂质；极 性比目标物强淋脱：流出目 标物活化：洗脱与 吸附剂作用比 目标物强的杂 质；极性比目 标物弱SPE的研究进展之一：新型吸附剂 n常规的SPE吸附剂类型共同的缺点：选择性差SPE的研究进展之一：新型吸附剂v抗体
7、键合吸附剂充分利用了生物免疫抗原抗体之间的高灵敏度和 高选择性，尤其适应于水中痕量有机物的富集与分离 ，将抗体键合到反相吸附剂的硅胶表面或聚合物表面 ，就制得了抗体键合吸附剂。研制开发能专门检测各 种优先污染物的单克隆或多克隆抗体已成为SPE技术的 前沿研究领域（如多环芳烃、多氯联苯、有机氯农药 、有机磷农药、以及一些环境激素类物质的单克隆抗 体等。缺点：生物活性物质易失活，缺乏保存和操作的 不稳定性，并且在制备和纯化方面条件苛刻，成本较 高，操作繁琐，费时费力， SPE的研究进展之一：新型吸附剂n v人工抗体吸附剂（分子印记聚合物，MIPs）基本原理：以目标分子（待测物）为印记分子，将结构互
8、补的功能 化聚合物单体分子通过共价键或非共价键的方式与印记分子结合形成 某种可逆的复合物，加入交联剂将这种复合物“冻结”起来，制得高 聚物，然后将印记分子提取出后所形成的对印记分子具有“预定”选 择性的分子识别位的大分子聚合物即为MIPs，又被称为“人工抗体” ，特点：特异性可以和生物抗体相媲美，同时具有一定的机械和化学 强度，对酸、碱、有机溶剂、温度和压力均有一定的耐受性，比生物 抗体易于合成和保存。目前MISPE用于复杂样品预处理和浓缩富集是 十分有效的。 分子印迹聚合物（MIPs）的制备过程分子印迹技术（molecular imprinted technology,MIT）分子识别设 想
9、首次合成发 展酶/底物 抗原/抗体 激素/受体Pauling 抗原为模板合成抗体，1940Wulff, MIP, 1972Mosbach, Nature ,1993SPE的研究进展之二：萃取方式n固相膜萃取将SPE吸附剂附载于微孔滤膜可以制成萃取膜，常用于处理大体 积水样。膜片0.45微米的孔径对过滤悬浮颗粒或微生物也有很好的 效果，是EPA推荐的样品预处理技术之一（EPA 525），并已开始在 国内应用。SPE的研究进展之二：萃取方式n固相微萃取（solid phase microextraction, SPME）SPME是在SPE技术的基础上发展起来的一项新的样品预处理技术 。它用一个类似
10、气相色谱微量进样器的萃取装置在样品中萃取出待 测物后直接与GC或HPLC联用，在进样口将萃取的组分解吸后进行色 谱分离与分析检测。该法从完成萃取到分析的整个过程只需十几分 钟，主要用于挥发性或半挥发性有机污染物的净化、富集。n基质固相分散技术（Matrix solid-phase dispersion,MSPD）1989年,美国Barker首次提出可同时分散与萃取固体、半固体样品 的MSPD技术。该方法将涂渍有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料 与样品一起研磨所得到的半干状态的混合物作为填料装柱, 然后采 用类似SPE的方法, 用不同的淋洗剂洗脱出各种待测物。与SPE比较, 优点:浓缩了传统
11、样品前处理过程中的样品均匀化、组织细胞裂解 、提取和净化等过程, 从而减少了组织匀浆、沉淀、离心、pH 调节 和样品转移等操作步骤，避免了样品的损失。适用于各种固体、半固体样品中农药多残留分析的提取净化。 SPE的研究进展之二：萃取方式nQuEChERS(Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe) 方法QuEChERS方法由Anastassiades和Lehotay等于2003年提出的一种 基于固相萃取和基质固相分散技术的样品预处理方法，具有快速 (quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠 (rugged) 和安全
12、(safe)等特点。步骤：首先用乙腈作为提取溶剂，振荡提取，同时加入氯化钠和 无水硫酸镁通过液液分配除水，然后取部分萃取液经无水硫酸镁和 PSA(N- 丙基乙二胺填料)分散固相萃取净化后,用色谱等进行分析。SPE的研究进展之二：萃取方式n搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)SBSE 技术由Sandra等在1999年首先提出并由Gerstel GmbH 商 品化，是一种新型的无溶剂或少溶剂，集萃取、净化、富集为一体 的样品前处理技术。萃取时，搅拌棒在完成搅拌的同时吸附目标物 ，可消除搅拌磁子的吸附竞争，同时使用非常简便。SPE的研究进展之二：萃取
13、方式(a)浸入式和(b)顶空式萃取方式(a)整体材料为涂层的SBSE示意图、(b)不同尺寸的 SBSEM 的照片和(c)SBSEM的截面图n磁性固相萃取(magnetic solid-phase extraction, MSPE)MSPE是一种以磁性或可磁化的材料作为吸附剂基质的一种固相萃 取技术，在MSPE过程中，磁性吸附剂不需要填充到吸附柱中，而是 被添加到样品的溶液或者悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁 性吸附剂表面，在外部磁场作用下就可使目标分析物与样品基质分 离开来。n优点： 1、萃取过程简单化，不需要昂贵的设备； 2、化学物质的使用量大为减少，没有二次污染产生； 3、可以萃取溶液
14、或悬浮液中的目标分析物，且由于样品中的杂质一般都是反磁性物质，能有效地避免杂质的干扰。 SPE的研究进展之二：萃取方式nSPE的在线联用技术越来越受到人们的重视，逐渐成为快速、灵 敏、可靠的分析方法之一。在线操作时，SPE柱富集的全部待分 析物直接进入仪器，使萃取效率大大提高，减少了操作者与有 毒试剂接触的机会，且缩短了分析时间。在线分析的重现性、 准确性都有较大改善，回收率也有较大提高，还能改善检测限 ，并适用于野外的实时自动化连续检测。SPE的研究进展之三：在线联用技术SPE的应用用SPE净化和富集的EPA方法Food Chemistry 93 (2005) 349353MISPENISP
15、EC18不同的固相萃取后HPLC检测干辣椒酱中的苏丹红MISPE的应用实例：干辣椒酱中苏丹红的检测固相微萃取（solid phase microextraction, SPME）n基本原理：利用待测物在基体和萃取相间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，达到待测组分进行提取和富集的目的。n于1989年由加拿大Waterloo大学的J.Pawliszyn教授等首次提出。1993年美国的Supelco公司推出了商品化的SPME设备。nSPME操作简单、携带方便、操作费用低廉，另外克服了SPE吸附剂孔道易堵塞的缺点。SPME的装置及萃取过程SPME的装置及萃取过程SPME方法分
16、为萃取过程和解吸过程：1.萃取过程。将萃取器针头插入样品瓶内，压下活塞，使具有吸附涂层的萃取 纤维暴露在样品中进行萃取，经一段时间后，拉起活塞，使萃取纤维缩回到起保护作用的不锈钢针头中，然后拔出针头完成萃取过程。2.解吸过程。热解析：在GC分析中采用热解吸法来解吸萃取物质。将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，压下活塞，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后续的气相色谱分析。溶剂解吸：利用HPLC专用的SPME解吸接口解吸或将萃取纤维插入一定的解吸溶剂中进行解吸，进入后续的HPLC分析。SPME的应用: 多环芳烃及邻苯二甲酸酯SPME的应用：PBDEsZhang W, Wu CY, Xing J, et al. Anal Chem, 2009, 81: 2912 图 水样中7种PBDEs的HSSPME-GC-ECD色谱图 1BDE-35；2BDE-47；
