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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PA G E） 博研联盟 - p o w e r e d b y p h p w i n d . n e t首页 | 博研FTP查询 | 博研博客 | 无图版 happy8048 退出 | 控制面板 | 短消息 | 搜索 | 社区服务 | 广告公司 | 在线时间换盟币 | 帮助 博研联盟 生命科学与医药学院 Life & Medical Science 生命科学 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）论坛简介 新人成长手册新人送威望活动 招聘版主进行中. 在论坛刊登广告 快速获得论坛盟币资助博研 本页主题: 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）打印 | 加为IE收藏 | 收藏主题 | 上

2、一主题 | 下一主题 9528 级别: 本科生 精华: 0 发帖: 160 威望: 27 点 盟币: 156 元 贡献值: 50 点 专业:农林 在线时间:70(小时) 注册时间:2006-11-29 最后登录:2007-09-04 您是本帖的第93位浏览者 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PA G E）原理 聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr），在交联剂甲 叉双丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物。 Acr的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基，过硫酸 铵TEMED

3、（四甲基乙二胺）和核黄素TEMED就是这样的催化诱发系统。前者发生化学聚合 作用，后者发生光致聚合作用。化学聚合时诱发剂TEMED加速过硫酸铵形成自由基，使Acr单体 转变为自由基态而导致聚合作用。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加 速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵 之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶 孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。 PAGE通常包括两种孔度的凝胶，即大孔度的浓缩胶和小孔度的分离胶，浓缩胶的浓度通常PAA量

4、 为4.5%，交联剂含量为2.5%。分离胶的浓度则因样品的分子量而不同，高浓度常用于分离低分子 量蛋白质。PAA量为7.5%的分离胶，对大多数生物体内的蛋白质的分离能有满意的结果。 根据样品分子量的大小可按下表选择合适的分离胶浓度。 凝胶浓度和交联剂浓度按下式计算： 电泳的支持物凝胶一般制备在玻璃管中或玻璃板上，所用玻璃管一般为8梍12cm长，内径5梍 8mm。进行电泳的电泳槽分上槽和下槽，两个相互分离的部分，各装有电极，通过玻璃管中的凝 胶，使它们连成导电的整体（图42）。电泳时带有电荷的分子在电场作用下发生移动，移动的速 度依赖于电场的强度、分子的净电荷以及分子的大小和形状，同时也取决于介

5、质的离子强度、粘 度和温度。由于PAA凝胶具有三维网状结构，能起分子筛效应，用它作为电泳支持物，把分子筛 效应和电荷效应结合起来，达到了很好的分离效果，而且方法也简单、快速，是植物生理生化研 究中常用的方法。_ h t t p : / / w w w . b y l m . n e t / f o r u m / r e a d . p h p ? t i d = 12 4511&f p a g e = 7 （第 15 页）2 0 0 7 -10 -2 0 17 : 43: 0 1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PA G E） 博研联盟 - p o w e r e d b y p h p w i n d

6、. n e t阳向极PAGE 用于分离酸性或中性蛋白质，电泳时蛋白质向阳极泳动。 仪器药品 稳压稳流电泳仪 真空泵 真空干燥器 电泳槽 微量加样器 6号长注射针 注射器 试剂贮备液： A1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。 B1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。 CAcr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。 DAcr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。 E核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。 F蔗糖40g，加蒸馏水配成

7、100ml。 G电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10 倍。 H过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。 I溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。 J脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。 K蛋白质染色液：考玛斯蓝G250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水80ml，溶解 后混合之。 L过氧化物酶染色液： 染色液甲：联苯胺抗坏血酸染色液，染色数分钟。 抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水 72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水

8、60ml。 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。 (1)0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定 容至100ml）。 (2)30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。 (3)邻联茴香胺（odianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。 用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。 操作步骤 h t t p : / / w w w . b y l m . n e t / f o r u m / r e a d . p h p ? t i d = 12 4511&f p a g

9、 e = 7 （第 2 5 页）2 0 0 7 -10 -2 0 17 : 43: 0 1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PA G E） 博研联盟 - p o w e r e d b y p h p w i n d . n e t1凝胶的制备 (1)分离胶：按ACH水=1241的比例，先将贮备液A，C和水放在一小烧杯中，贮 备液H放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将H并入，用玻棒 轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻管中。玻管的底部要密封，并垂直放置，用滴管吸取混合 液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离管口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静 置1小时左右，当见到

10、水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面 水层。 (2)浓缩胶：按BDEF=1214的比例，同上法制备浓缩胶，加到已凝固的分离胶上 面，高度约1cm，同样覆盖一层蒸馏水。置于日光灯下照光约1小时，直至凝固，吸去上面水层， 待用。 2加样及电泳 (1)取贮备缓冲液G200ml，加预冷的蒸馏水1800ml，稀释10倍，取1000ml倒在电泳槽的下 槽。 (2)除去凝胶管底部的密封，插入电泳槽中。 (3)取实验89中经硫酸铵分级沉淀的过氧化物酶透析液，用取样器于每管的胶面上加入样品 100l（含蛋白质50100g，如浓度过稀，可把酶液装在透析袋中，用蔗糖浓缩），然后用稀 释

11、的溶液G，小心地将每管充满。 (4)在电泳槽的上槽同样倒入稀释10倍的缓冲液G，缓冲液中加入1ml溴酚蓝溶液I。 (5)连接好导线，将上槽接到电泳仪的（）极，下槽接（+）极。开启电泳仪电源，调节输出 电流，使每管电流强度为2mA，通电15分钟。然后增加电流使每管达5mA，大约经过23小时， 直至管中的染料迁移到离管底5mm左右，停止通电，结束电泳，取下胶管。 3脱胶及显色 (1)取50ml注射器灌满水，配上6号长针头，将针头插入胶与管壁之间，一边注水一边将针头向 前推进，直至把凝胶从管中脱出。如果凝胶还不能脱出，可用洗耳球从管口上端压入空气，促使 凝胶自管内脱出。 (2)将胶分成二组，一组用考

12、玛斯蓝G250进行蛋白质染色；另一组置于过氧化物酶染色液甲 或乙中进行染色。 (3)取出经过染色的凝胶，用水冲洗数次，然后置于脱色溶液J中进行脱色，除去凝胶的本底颜 色，使色带更为清晰。 (4)绘图比较蛋白质带和过氧化物酶活性带。 阴极向PAGE 用于分离碱性蛋白质，电泳时蛋白质向阴极泳动。 试剂贮备液： AKOH2.7g，冰醋酸17.2ml，TEMED4.0ml，加蒸馏水配成100ml。 BKOH2.7g，冰醋酸2.87ml，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml。 CAcr30g，Bis0.8g，加蒸馏水配成100ml。 DAcr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。 h

13、 t t p : / / w w w . b y l m . n e t / f o r u m / r e a d . p h p ? t i d = 12 4511&f p a g e = 7 （第 35 页）2 0 0 7 -10 -2 0 17 : 43: 0 1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PA G E） 博研联盟 - p o w e r e d b y p h p w i n d . n e tE核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。 G电极缓冲液：31.2g丙氨酸，冰醋酸8ml，加蒸馏水配成1000ml，pH4.5。 H过硫酸铵0.28g，加蒸馏水配成100ml。 I0.1%碱性品红（Ba

14、sic fuchsin）水溶液，用作电泳指示染料。 J甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml，用于脱色。 分离胶：ACH水=1241。 浓缩胶：BDE水=1214。 电极缓冲液G不必稀释，直接加在上、下槽中，注意上槽应接电泳仪（+）极，下槽接（） 极，以碱性品红染料作指示剂，其他所有操作同上。 注：本实验所用药品Acr，联苯胺，联茴香胺对人体有毒性，防止接触皮肤及吸入。 本帖最近评分记录： 盟币:+10(yexuqing) 谢谢分享！Posted: 2007-08-30 17:49 | 楼 主 博研联盟 生命科学 快速发帖顶端内容 HTML 代 码不可 用 Wind Code Ope

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16、e r e d b y p h p w i n d . n e tTotal 0.120448(s) query 5, Time now is:10-20 17:39, Gzip enabled 黑ICP备05007752号 Powered by PHPWind v5.3 Certificate Code 2003-07 PHPW Corporation Contact us | Wap | Top h t t p : / / w w w . b y l m . n e t / f o r u m / r e a d . p h p ? t i d = 12 4511&f p a g e = 7 （第 55 页）2 0 0 7 -10 -2 0 17 : 43: