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1、生物技 术一,硅酸盐细菌和苏云金芽抱杆菌原生质体融合唐宝英朱晓慧刘佳江苏省徽生物研究所,无锡,、具 有解钾活性的硅酸盐细菌胶质 芽饱杆 菌二。“。二。一与具 有杀虫活 性 的苏云 金芽抱杆 菌如,切。二。原生质体 质进行了融合。一原生质体形成率为再生率为,原生质体形成 率为,再生率为。以为助融剂进行原生质体融合得到个融合子融 合率为又一。融合子在双杭选择培养基上连续传代次,得到个稳定的融 合 子,生物浏定表明,融合 子 既具 有一定的杀虫活性又具有一 定的解钾活性。关键词硅酸盐细菌,苏云 金芽饱杆 菌原生质体融合杀虫活 性 解钾活性原生质体技术已成为基础分子 生物学和微生物 育种 的一种有效方
2、法。芽抱杆菌属种间融合的研 究已有很多报道,但对具有 硅 酸盐分 解能力 的硅酸盐细菌 胶质芽抱杆菌和具有 杀虫 活性 的苏云金芽抱杆菌之间的融合研究迄今未见报道。本试验试图通过原生质体融合技 术获得 既具杀虫活性又有解钾活性的融合子,为组建有益于农业发展的,具有多种优良性 状的新型菌株探索新 的途径。材料和 方法菌种苏云金 芽抱杆菌,。蕊一、硅酸 盐 细菌落二。 。一分别 由本所保存的和中筛选得到。培养基培养基蔗糖,。,玻璃粉,琼脂,培养基培养基 中加蔗糖,顺烯二酸收稿日期一一,培养基蛋白陈,牛 肉膏,琼脂,一培养基培养基 中加蔗搪一,顺烯二酸一液体培养基蔗糖,淀粉,硫 酸馁,酵母膏,一液体
3、培养基蛋 白陈,牛肉青,一,一选择培养基培养基 中加人链霉素件,氨节青霉素以一选择培养基培养基 中加人链霉素协,氨节青霉素一主要溶液缓 冲 液蔗糖,顺丁烯二 酸,蔗糖,一,顺丁烯二酸,溶液飞聚乙二醇分 子 量溶于溶液中生物技术卷期新 生钙溶液的与。的等体积混合。原 生质体制 备与再生一的原生质体制备与再生采用如下方法将新鲜 斜 面 接人 液体 培养基中一培 养 过 夜,再以接种量接人新鲜 液体培养 基中,振 荡培养到对数期。离心,收 集 菌 体,用缓冲液洗涤两次。悬于溶液 中,预热加、的溶菌酶酶 解。以培养 基为再生培养基,为普 通培养基计 算 原生质 体形成率和再生率。门的原生质体制 备 与
4、再生参 考文献仁“并加以改进 采用液体培养基振荡培 养,再以接种量 转种量 转接人新鲜 液体培养基中,振荡培养后加人以青霉 素钠,继续 振荡培养,离心收 集 菌体,用缓冲液洗涤两次后在 菌悬液 中 加人的 溶 菌 酶,一酶 解。以培养基为再生培养基为普 通 培 养基,计算原生质体形成率和再生率原生 质体融合将 两亲本原生质体 各取按比例 混合,离心,沉 淀物 中加人和一新生钙 液 摇匀置水 浴 保 温,离心沉淀,用缓 冲液稀释,并涂于选择性培养基平板 上,置一温箱培 养天,在 此平 板上生 长的可初步断定为融合子。融合子的生物学特性遗传稳定性测定 在选择性培养基上连续转接传代,观察融合子生长情
5、况。菌体形 态与菌落形态的观察 将培养的菌体徐于 载玻片上,染色后 观察菌体及伴抱 晶体的形态,用和培养基平板分别观 察菌落形态。杀虫活性 的测定以沾菌吕抱子新鲜油菜 嫩 叶饲 喂二龄小菜蛾,以沾菌新鲜玉米嫩 叶饲喂二龄玉米螟无菌叶饲喂对照虫。保湿保温饲养天,计算致死率及校正致死率。结果原生质体的形 成及再生一原生质体的形成与再生试验了菌 龄、高渗 缓 冲液浓度及溶菌酶浓度对原生 质体形成与再生的影响。通过反复试验 证明对一原生质体形 成影 响最大的 因素 是 高渗缓 冲液浓度,特别是其中的顺 丁烯二酸的浓度见表。当顺丁烯二酸浓度为时,溶 菌酶浓度只需厂在今酶 解,原生质体形成率即可达编而顺丁
6、烯二酸 浓 度 为时,即使溶 菌酶 浓 度增加到,在 同样的酶 解条件 下 酶 解,原生质体形成率也仅 为。一原生质体形成和再 生的最佳条件 为 菌种活化时间为,溶菌酶浓度 为,酶解 时 间为,高渗缓冲液为缓 冲 液,在上述条 件下,以为再生培 养 基,原生质体 形 成率可达”,再生率可达。表高渗级冲液浓度对一原生质体形成的影响高高渗缓冲液液顺丁烯二 酸酸顺丁烯二酸酸功顺 丁烯二酸酸顺丁烯二酸酸浓浓度度十十原原生质体体注菌种活化时 间为一,酶浓度一,醉解沮度峨,时间,蔗精一唐宝英等 硅酸盐细菌和苏云金芽抱杆菌原生质体融合原生质体的形成及再生影响原生质 体 形 成的 关键因素是 菌体活化培养的
7、时间,原生质体形 成率与菌体活化培养时 间呈 负相 关见表,与酶浓度呈正相关,而再生率与之相反。用活化的菌 体 在 溶 菌酶 浓度,酶解较理 想,原生质体 形 成率可达,再生率可达。表菌龄对原生质体形成的影响酶解前 菌种活化时间原 生质体注活化培养过程的最后添 加的青霉素钠酶浓度醉解沮度时间原生质体融合以抗药性 为遗传标记,采用直接选择法,将融合处理后 的原生质体涂在选择培养基平板上,经培养有个菌 落生 长 良好,视 为融合子 融合率达又一。融 合子 的生物学特性遗传稳定性融合子在选择培养基双抗平板上连续转接传代,随着传代次数的增加,能在选择 培养基上生长的融合子数目逐渐减少,传代次后,有个融
8、合子仍良好生长,说明此个融合子的遗传性很稳定。本试验重 点对融合子一进行了生物学测定。菌 落、菌体及伴 抱晶体 的形态观察融 合子一的营养体 介于双亲之间。它在培养基上 的菌落形态似一,而在培 养 基上的 菌落形 态似一,而它 的 亲 本一在培 养 基 上不能生长,一也不能在平板 上 生长,融合子一能 形成菱 形 伴泡 晶体,其大 小与亲株一相仿。解钾活性的观测在培养基 上 生长的快慢可在一定程度上反映菌株分解硅酸盐能力的强弱气融合子一能在培养基平板上迅 速生长 说明它具有一定的解 钾活性。杀虫 活性 的测定一对 二龄玉米螟和 小菜蛾有较 高的杀虫活性,一对 两者均无杀虫 活性,融合子一对二龄
9、玉米螟的杀虫活性接近一而对二 龄小菜 蛾的杀 虫活性 略 低于一。讨论遗传性稳定的融合子一,其营养体和菌 落形态具有双重性,在平板上 近似于一,而在平板上近似于一,能形 成伴抱晶体,具有 一 定的杀 虫活性,并能在 硅 酸盐平板上迅 速生长,说明其具有一定的解钾能力。综上所述,融合子一表达了双亲特性,但它是否能应用于 农业生产,还有待进一步的实 验加以证实。参考文献【王岳五,陈月华,陈 宁等生物 工 程学 报,一 【乔宝义,徐浩微生物学 报,一久刘伊强,王雅 平潘乃随喊主初字稚, ,月,月,一刘金屏,曹文伟,张楚佳微 生 物学报,一 【 童望宇,张克旭,贾 士语微生物学通报,一下转第页钱锋等 影响细胞 电穿孔效率的因素日一一,一,日一接第页月诬江州几、一圣几客“夕翻一如“诬少二“云介。甜一,趾护介夕,台一,乙乙赵,乙“尹云砚乙,接第页 匕一礴月红 ,。一门,月月。一匕月。比一,一多一,月一一,刁一,一,一,一。, 。一一一吕。一,一 目一叩耽加。“,卫 一通多,一,倪耐泪卜,。目一,月一,魂月,峨。川阮。,内部资料月 刁孙一,月刁。,月“。川,月多阮丁耐一,张改平中国抗生素杂志,盯
