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1、大鼠神经来源的孤儿受体l 全长c D 卜J A 的克隆及其对复极化诱导的小脑颗纰冲经元捅亡的保护作用中文算要大鼠神经来源孤儿受体1 全长e D N A 的克隆及其对复极化诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用专业：药理学博士生：银巍导师：颜光美教授摘要神经元凋亡在神经系统发育过程中起着极其重要的作用。在成年个体，不再分裂的神经元不能或很少再更新，褐亡性细胞丢失已经被证明是慢性神经褪行性疾病中的一个主要病理因素之一。神经元凋亡与存活分子机制的研究对于神经褪行性疾病的治疗有着重要意义。凋亡是细胞主动的死亡方式，需要启动细胞内一系列生化机制，并且受到精细的调控。已经发现和其他类型细胞一样，神经元的凋
2、亡与存活是受到进化过程中非常保守的机制调控，许多诱导或抑制凋亡的基因已被克隆和鉴定，发现了一些凋亡和存活信号通路，但目前所有的关于神经元凋亡与存活的知识不能完全解释一些神经元的生死取向。另外由于终末分化的神经元具有结构和功能上的特殊性，并不清楚神经元是否还有有别于其他类型细胞的细胞保护机制。本室前期工作表明已经凋亡的小脑颗粒神经元可以在一定条件下发生逆转，并且这种逆转作用是不依赖于常见的A k t ( p r o t e i nk i n a s eB ，P K B ) 和E R K l 2 ( e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dk i n a
3、 s e1 2 ) 促神经元存活信号通路进行，可能存在新的促存活通路发挥作用。本课题以大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型为基础，应用m R N A 差异显示P C R 技术，试图从m R N A 的差异表达入手筛选与小脑颗粒神经元凋亡或存活相关基因，并阐明其功能。通过D D R T - P C R 我们获樗1 6 4个在小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中差异表达的表达序列标签( e x p r e s s i o n丈鼠丰嘣窘I 毪瞒吼儿受体l 全长c D N A 的克隆及其对复极化诱导的小膨劂萄橙；谢耐r 柏保护作用中文麓耍s e q u e n c e t a g ，E S T ) ；我们对其中的1
4、 7 个E S T s 进行了克隆并测序；通过反N o r t h e m杂交的初步筛选初步鉴定出5 个阳性片段，其中2 个在小脑颗粒神经元凋亡过程中表达上升，3 个在细胞凋亡逆转过程中表达上升；对其中在细胞凋亡逆转过程中表达上升7 5 AE S T 我们再一次通过N o r t h e r n 杂交以及R T - P C R 的办法进一步证明是阳性片段；在同源性检索未找到其同源基因的情况下，我们采用T 4 D N A连接酶介导的c D N A5 末端快速扩增( R a p i dA m p l i f i c a t i o no fc D N AE n d s ，5 R A C E ) 的
5、方法首次克隆了神经来源孤儿受体1 ( n e u r o n - d e r i v e do r p h a nr e c e p t o r - 1 ，n o r l ) 基因的全长c D N A ；为确定N o r l 在小脑颗粒神经元凋亡中所起的作用，我们构建了重组腺病毒表达系统；通过腺病毒介导的N o r l 的过表达保护复极化诱导的小脑颗粒神经元的凋亡，我们初步判定N o r l 具有神经元保护作用。大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中凋亡和存活相关差异表达基因的筛选与鉴定研究，为本室凋亡逆转模型的研究开辟了一个新的领域，并为其分子机制研究奠定基础。n o r l 的全长e D N A
6、 克隆是研究N o r l 在大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中的作用的前提。作为潜在的新的神经元保护因子，N o r l 对小脑颗粒神经元凋亡保护作用的鉴定可能为发现新的神经元保护分子机制打下基础。第1 章应用m R N A 差异显示技术筛选大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中差异表达基因本章应用m R N A 差异显示技术对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中差异表达基因进行筛选，克隆以及鉴定，为凋亡逆转分子机制研究奠定基础。方法大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型进行荧光m R N A 差异显示逆转录P C R ( F D D R T - P C R ，F 1 0
7、r c s c e n td i f f e r e n t i a ld i s p l a yR T - P C R ) ；E S T 片段亚克隆入p G E M TE a s y T M ，克隆后测序并进行序列同源性检索；反N o r t h e m 杂交重鉴定与筛选；N o r t h e r n 杂交鉴定；逆转录P C R 鉴定。结果通过D D R T - P C R 我们获得1 6 4 个在d 、脑颗粒神经元凋亡逆转模型中差异表达的E S T s ；我们对其中的1 7 个E S T s 进行了克隆并测序；通过反N o r t h e m杂交的初步筛选初步鉴定出5 个阳性片段，其中2
8、 个在小脑颗粒神经元凋亡过程大鼠神经来源的孤儿受体1 全长c D h A 的克隆及其对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用中文麓翼中表达上升( 其中1 6 4 E S T 为M u s m u s c u l u s A T P - b i n d i n gc a s s e t t e p r o t e i n ；l 号E S T 未检索到同源序列) ，3 个在细胞凋亡逆转过程中表达上升的E S T s ( 7 5 A E S T ，1 2 0 DE S T 未检索到同源序列，3l 号E S T 为R a t t u sn o r v e g i c u ss i m i l a r
9、t o5 - 3e x o r i b o n u e l e a s e2 ) ：对其中在细胞凋亡逆转过程中表达上升7 5 AE S T 我们再一次通过N o r t h e r n 杂交以及R T P C R 的办法进一步确认了其在小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中的表达模式，证明是阳性片段。结论差异显示技术是一种较为快速、简便、灵敏的筛选差异表达基因的好方法：阳性差异表达E S T 的筛选、克隆以及鉴定为凋亡逆转分子机制研究奠定基础。第2 章n o r l 全长e D N A 的克隆及其表达7 5 A E S T 在G e n B a n k 进行同源性检索没有检索到明显同源基因；但在大鼠基因
10、组检索提示我们它可能和神经元来源的孤儿受体1 基因有关。但7 5 AE S T是未克隆的新基因还是n o r l 的其他剪切方式并不清楚，因此有必要从试验上克隆7 5 AE S T 全长e D N A 。本章应用T 4D N A 连接酶介导的e D N A 5 末端快度扩增法来克隆7 5 A E S T 的全长e D N A 。在克隆全长n o r le D N A 后，从m R N A 和蛋白水平分析了N o r l 在小脑颗粒神经元凋亡逆转模型中的表达。方法小脑颗粒神经元的分离培养及凋亡检测同第一章：T 4 D N A 连接酶介导的e D N A5 末端快度扩增法来克隆7 5 AE S T
11、 的全长e D N A ；w e s t e r nb l o t t i n g 蛋白免疫印迹法检测N o r l 蛋白表达水平；R T - P C R 观察n o r l 基因的表达水平：结果在克隆7 5 A E S T 的全长e D N A 中，第一轮P C R 得到约2 7 k b 的P C R产物，第二轮巢式P C R 扩增出约2 S k b 的P e R 产物，前后两轮扩增产物分子量大小相差约2 0 0 b p ，与引物设计位置一致。克隆后测序结果在G e n B a n k 检索发现其5 端1 5 k b 与神经元来源的孤儿受体基因3 端完全同源：再通过两轮R A C E我们获得
12、N o r l 基因长为5 6 5 9 b p 的全长c D N A ，与我们在第章中的N o r t h e m杂交结果一致。用用位于n o r l 基因编码区的引物成功扩增出5 4 0 b p 左右的P C R产物，并且和7 5 AE S T 有一样的表达模式，进一步表明7 5 AE S T 的确是n o r le D N A 的部分序列aW e s t e r nb l o t t i n g 的结果显N o r l 蛋白水平在小脑颗粒神经元进行钾撤除4 小时后有明显的下调，即在凋亡过程中表达下调；小脑颗粒神经元大鼠神经来源的孤儿受体l 全长c D N A 的克隆及其对复极化诱导的小嘀髓
13、| 蜜冲经元捅亡的保护作用中文摘要在钾撤除6 小时后再恢复到2 5m m o l L 1 K C I 的培养条件即重新去极化处理逆转凋亡时，N o r l 蛋白水平2 小时内就有上升。结论T 4D N A 连接酶介导的c D N A5 末端快度扩增法高效率的扩增全长c D N A 的方案；成功克隆全长n o r le D N A ；N o r l 的表达伴随着小脑颗粒神经元的存活或凋亡逆转过程，N o r l 可能具有神经元保护作用。第3 章腺病毒介导的N o r l 过表达对小脑颗粒细胞的保护作用N o r l 属于核孤儿受体亚家族N R 4 A ，家族其他两个成员是N u r 7 7 (
14、o r p h a nn u c l e a rr e c e p t o rN G F I B ) 和N u r r l ( N u c l e a rr e c e p t o r r e l a t e d1 ) 。N o r l 核孤儿家族成员可以由多种信号刺激表达，其功能随着细胞种类，刺激因素的改变而改变。N o r l 及其家族成员广泛参与多种生理、病理过程，是一些多功能蛋白。N o r l 即参与了细胞的凋亡，又参与了神经元存活与分化，还介导肿瘤发生和细胞增殖。我们拟运用腺病毒介导的过表达N o r l 来观察小脑颗神经元在去极化和复极化培养中的存活情况来判定N o r l 的作
15、用。方法小脑颗粒神经元的分离培养同第一部分；复极化诱导小脑颗粒神经元凋亡模型参照文献：重组腺病毒载体构建；重组腺病毒载体转染到2 9 3 细胞中包装病毒；腺病毒的P C R 和W e s t e r nB l o t 鉴定；C s C L 密度梯度超速离心纯化重组腺病毒及滴度测定；重组腺病毒感染小脑颗粒神经元；H o e c h s t 3 3 2 5 8 染色判定细胞凋亡：W e s t e r nB l o t 检查了N o r l 在重组腺病毒感染的小脑颗粒神经元复极化诱导的凋亡模型中的蛋白表达水平；计数以i s D 表示，采用t 检验和方差分析结果N o r l 全长编码区( 6 8
16、1 - - 2 7 9 9 b p ) 亚克隆到p C R - X L T O P O 载体上，测序鉴定后克隆如腺病毒穿梭载体p A d T r a c k C M V ，然后在A d E a s i e rC e l l s 中与腺病毒骨架载体p A d e a s y 一1 同源重组为重组腺病毒表达载体p A d e a s y - N o r l 。P a c I线性化后成功转染到人胚肾2 9 3 细胞，并在2 9 3 细胞中进行重组腺病毒包装。P C R和W e s t e r nB l o t 的鉴定结果表明腺病毒正确构建；经过C s C L 密度梯度超速离心纯化重组腺病毒后进行滴度测定，r A d - N o r l 和r A d G F P 的滴度为5 1 x 1 0 儿和8 2 x 1 0 “。腺病毒对小脑颗粒神经元的感染以3 0 0 比1 的比例进行感染时，约5 0的神经元可以被感染，并且没有细胞形态学病变( c y t o p a t h o l i ce f f e c t s ，C P E ) 。感染r A
