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1、第四章蛋白质的共价结构（一）蛋白质的化学组成和分类1、 元素组成碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮6.252、 氨基酸组成蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长链分子一、 蛋白质通论3、 分类（1） 按组成： 单纯蛋白质：只含氨基酸成分；可以根据其物理性质进行 分类 缀合蛋白质：氨基酸 + 辅基（配体）；可以按其非氨基酸成分进行分类（2）按生物学功能： 酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、 结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白、异常蛋白。（二） 蛋白质分子的形状 和大小1 形状纤维状蛋白质：具有比较简单球状
2、蛋白质膜蛋白质2 大小少于50个氨基酸的低分子量多聚物称为肽， 寡肽或生物活性肽，有时也称多肽。多于50个氨基酸的称为蛋白质。蛋白质分子量 = 氨基酸数目*110蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。一级结构：氨基酸顺序二级结构：螺旋、折叠、转角，无规卷曲三级结构： 整个肽链（亚基）的形状；四级结构 ：亚基之间的聚集形式。（三） 蛋白质的构象和蛋白 质结构的组织层次（四）蛋白质功能的多样 性 催化酶，生物催化剂 调节激素蛋白类，调节体内的物质代谢过程或参与 基因表达的调控 转运运输蛋白类，通过血流或膜通道转运特定的物 质 贮存能贮存氨基酸等，作为机体的营养物，在需要 时提供各种元素 运动
3、使细胞或生物体发生运动 结构成分具有强大的抗拉作用，对机体起支持作用 支架作用在细胞应答激素和生长因子的途径中起作 用 防御和进攻在细胞防御、保护和开发方面的主动作 用 异常功能二 肽 肽 (peptides)是由氨 基酸通过肽键连接起来 的一类有机物。根据其 所含氨基酸残基的数量 ，有小肽和多肽之分。 小肽一般是指不到10个 氨基酸所组成的肽，多 肽一般是指1050个氨 基酸所组成的肽。（一） 肽键与肽 链 肽键： 一个氨 基酸的 羧基与 另一个 氨基酸 的氨基 之间失 水形成 的酰胺 键。肽键的特性氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用：肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转
4、。在大多数情况下，以反式结构存在。组成肽键的原子处于同一平面-肽平面。肽键的结构特点： 酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。 肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。 肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个C几乎处在同一平面内（酰氨平面）。 肽键亚氨基在pH0-14内不解离。 肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型肽 链由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基 酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽链中AA的排列顺序和命名v 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序 称为氨基酸顺序。v 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基
5、，称为氨基端或N -端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。v 氨基酸的顺序是从N端的氨基酸残基开始，以C端氨基酸残基 为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 旋光性：一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 肽的酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 肽的酸碱性质主要取决于端和端COOH以及侧链上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。（二）肽的物理和化学性质4） 原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH 小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该 侧链的共
6、轭酸。3. 肽的化学反应：肽的-羧基，-氨基和侧链R 基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似 的反应，如茚三酮反应、Sanger反应、DNS 反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应（ 含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4 碱性溶液发生反应生成紫红色或蓝紫色的复 合物。氨基酸无该反应）。（三）天然存在的活性肽 一些小肽在动物体内主要用于合成蛋白质，作为体蛋白的 结构组分， 因而称之为结构肽(structural peptieds)。 另有一些肽类物质，在体内并非用于合成蛋白质，而是独 立发挥其特定的生物学功能，一般称之为生物活性肽 （ bioactive peptides），简称活性肽；
7、 也称功能肽（ functional peptides)。 已为人们广泛熟悉的表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF)、成纤维细胞生长因子（ fibroblast growth factor, FGF）、类胰岛素生长因子（insulin- like growth factor, IGF)均为典型的生物活性肽。1 谷胱甘肽(GSH)GSH的功能 SH缓冲剂：保护血液中的红细胞不 受氧化损伤，维持血红素中半胱氨酸处 于还原态 解毒作用：GHS可与过氧化氢或其它有 机过氧化物反应 参与氨基酸的转运2、 短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌 ，临床
8、用于治疗化浓性病症。L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL- OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val 3、 脑啡肽（5肽）Met- 脑啡肽： TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽： TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。生物体内寡肽的来源： 合成蛋白质的剪切、修饰 酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、 动物肠道可吸收寡肽4、肽类激素 一级结构 ：蛋白质 多肽链中 氨基酸残 基的排列 顺序 表示方法 ：N-末端 向C-末端 维持力： 肽 键、 二硫键三、 蛋白质一级 结构的测定（一） 蛋白质测序的策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测6
9、0个N端氨基酸。1、直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）3 测序前的准备工作1）蛋白质的纯度鉴定纯度97%以上，均一。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸2）测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数 SDS-PAGE凝胶过滤法沉降系数法4 蛋白质测序的一般步骤（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目；（2）拆分蛋白质分子中的多肽链；（3）断裂链内二硫键；（4）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5）鉴定多肽链的N末端和C末端残基；
10、 （6）裂解多肽链成较小的肽段；（7）测定各个肽段的氨基酸顺序；（8）确定肽段在多肽链中的顺序；（9）确定多肽链中二硫键的位置。（二）N 末端和C-末端氨基酸残基的鉴 定1 N-末端分析DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解 后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基 酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、 液相等PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂 抽提，层析。 2 C-末端分析肼解法 无水肼NH2NH2 100 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上
11、 清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。羧肽酶法（Pro不能测） 羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、LysN H2N ValSerGly C图 P118 羧肽酶法测C末端（三）二硫桥的断裂过甲酸氧化： SS + HCOOOH SO3H巯基乙醇还原（四）氨基酸组成的分析酸水解的同时辅以碱水解（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的 分离纯化1 酶裂解法1）胰蛋白酶 Lys X (X Pro) Arg X 2）胰凝乳蛋白酶 TyrX (X Pro) TrpXPheX 3）嗜热菌蛋白酶Leu (Trp、 Try、Phe ） X (X Pro/Gly
12、) 4）胃蛋白酶Phe(Trp、 Try、 Leu)Phe(Trp、 Try、 Leu)2 化学裂解法 溴化氰 MetX 产率85% 亚碘酰基苯甲酸 TrpX 产率70-100% NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）XCys 羟胺NH2OH AsnGly约150个氨基酸出现一次3、 肽段的分离纯化 电泳法 根据分子量大小分离 离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）根据肽段的电荷特性分离 反相法根据肽段的极性分离 凝胶过滤要求： 单带单峰端单一（常用c l法）四 蛋白质的一级结构 与生物功能（一） 同源蛋白质的物种差异与生物进化1 同源蛋白质：在不同的生物体内行使
13、相同或相似功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能， 细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种 间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。同源蛋白质的特点： 同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列 同源性） 有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的， 称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有 很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸 的变化不影响蛋白质的功能。 多肽链长度相同或相近2 细胞色素C 分子量：12500左右 氨基酸残基：1
14、00个左右，单链。 25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。 60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。 亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。 亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。 人与黑猩猩 0 人与猴 1 人与狗 10 人与酵母 44细胞色素C 功能:传递电 子 多肽链，血红 素，铁原子胰岛素有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其 余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免 疫反应起作用。猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人 的糖尿病。3 系统树 （二） 同源蛋白质具有共同的进化起源1 氧合血红素蛋白质 丝氨酸蛋白酶类3 功能差异很大的蛋白质（三）血液凝固与氨基酸序列的局部 断裂 1、 血液凝固中的级联过程2 凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作 用在凝血酶原致活因子催化下，凝
