大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其转化研究

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1、鍪主笙苎：奎兰茎缝整茎整茎堡基薹塑塑塑璧墨茎望垡篓茎致谢首先我要感谢我的导师炅平教授能够提供浅这个学习机会，使我对科学研究有了更进一步的认识。他严谨的科学态度，活跃的科研思维以及崇高的敬业精享申给我爨下了深刻的印象。我还要感谢寿惠霞教授在我学习期阕对我的悉心指导，鼓励和帮助，她让我知道了如何成为一个优秀的科研工作者：勤奋、毅力和誊献。所有的这些瓤将馒我受莛一生。我要感谢嚣年来疑有亵助过我戆老蜉粕同学。感谢毛传澡意颊，陈汉怒老掇，吴惠长老爨，燹运荣老帮在我数磺究i 篷程中绘予鹣建议农指导。感谢李衾耀鼯冗和我共礴完成蔫絮静部分工终。感谢嚣骁薇搏鼹，郑荣痰图擎，王型羼学，残瑷蘑学稻零小汀嗣学，在学习

2、帮生活等诸多方蘑对筏懿帮助。勐。感落实验室各位亦辩夯友豹藤发，及箕健奁实验室工佟学习斡图拳对我的帮最后，我要袁，I i , 地感谢我的父母和我的勇精友，感谢谴们对我生活上籀学习上的关心、鼓励和支持，便我得黻顺剥缝完成两年的学渡。2 0 0 6 年5 月1 5 日子杭州磺士论文：大豆 绿律转纯载髂姆系列静秘建及其转纯研究摘要杂交大甄是我闺具秘主知识产衩的科研成莱，其有广阔的应掰前景。为解决杂交大豆翎种过程中不裔系荔与保持系灞杂的阏题，我们开展了大豆叶绿体转基因的研究，目的愚通过转基因的方法在不育系的细胞质中，植入筛选标记熬因，以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列( G e n B a

3、 n 叠X 0 7 6 7 5 ) 设计引物，用p C R 方法获得两段大厦叶绿体同源重组序列L H R R 和R H R R ，克隆到质粮p U C l 9 中，并将来源于质粒p T F l 0 2 的壮观艨素抗性基因a a d A 克隆到两段同源重组序列之间以构建大豆叶绿体转化浅达载体p J Y 0 1 。a a d A 基因的启动子P r m 和终止子p s b A撼因3 序列，分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上，我们还将草丁膦抗性基因和绿色荧光蛋白与G U S 的融合鬣自基因分别克隆剐该裁体上，得到p J Y 0 3 和p J Y 0 4 ，并初步应用于烟草的叶绿体转化，获得

4、了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗，P C R 检测出a a d A 基因的条带，并谯激光共聚焦扫描下检测到G F P 的表达，由此证实了这一实验思路的可行性，为后期大豆时绿体转化工作的顺利进行打F 了良好的基础。关犍谗l 大露；睁绿体转纯；表达鼓髂；G F P2硕士论文：大豆叶绿体转化载体p l y 蒜列的构建及熊转化研究A b s t r a c tH y b r i ds o 如e a ni so n eo ft h em o s ts i g n i f i c a n ts c i e n t i f i ca c h i e v e m e n t st h a tC h i n e

5、 s es c i e n t i s t sa r eh o l d i n gt h ei n t e l l e c t u a lp r o p e r t y W h i l et h ei n v e n t i o ni m p m v e dt h es o y b e a ny i e l dg r e a t l y , t h ed i f f i c u l t yt oe l i m i n a t et h em a i n t a i n f i n es e e d sf r o mt h ec y t o p l a s m i cm a l es t e r

6、 i l el i n es e e d si so f t e nap r o b l e ml i m i t i n gt h ea p p l i c a t i o no ft h en e wt e c h n o l o g y T os o l v et h ep r o b l e m ，w ei n i t i a t e dt h e r e s e a r c h T h ep u r p o s eo ft h er e s e a r c hi st oi n s e r tas e l e c t a b l em a r k e rg e n ei n t ot

7、 h ec y t o p l a s mo ft h em a l es t e r i l el i n et h r o u g hc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nB a s e do nt h ep u b l i s h e ds o y b e a nc h l o r o p l a s tg e n o m es e q u e n c e ( G e n B a n kX 0 7 6 7 5 ) ，t W Op a i r so fp r i m e r sw e r es y n t h e s i z e d

8、t oa m p l i f yt w oa d j a c e n ts o y b e a np l a s t o m es e q u e n c e sa l l o w i n gi t st a r g e t e di n s e r t i o nb e 晰e e nt h et m Vg e n ea n dt h er p s l 2 7o p e r o no fs o y b e a np l a s t i d W i t h i nt h el a r g e t i n gr e g i o n ，a l la a d Ag e n ee n c o d i n

9、 gt h eA m i n o g l y c o s i d eA d e n y l y l t r a n s f e r a s ew a si n s e r t e d T h eg e n eW a sf l a n k e db yt h er r np r o m o t e ra n dt h e3 s e q u e n c eo f p s b Ag e n e T h ec o n s W u c t e dv e c t o rw a sd e s i g n a t e da s p J Y 0 1 ，E x p r e s s i o nc a s s e t

10、 t e so f b a r g e n ea n dG F P - G U Sf u s i o ng e n ew e r et h e ni n s e r t e di n t ot h ep J Y 0 1v e c t o rt oc o n s t r u c tt w on e wv e c t o r s ：p J Y 0 3a n dp J Y 0 4 ，w h i c hw es u c c e s s f u l l yw a n s f o r m e di nt h et o b a c c oc h l o r o p l a s t W ed e t e c

11、t e dt h ee x p r e s s i o no ft h ea a d Ag e n eb yP C Ra m p l i f i c a t i o na n df o u n dt h a tt h et r a n s f o r m e ds e e d l i n g sc o n f e r r e dg r e e nf l u o r e s c e n ta c t i v i t y T h i sr e s e a r c hb u i l das o l i db a s ef o rt h ef u t u r es o y b e a nc h l o

12、 r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n K e y w o r d s ：s o y b e a n ；c h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n ；e x p r e s s i o nv e c t o r s ；G F P3碰士论文；犬豆叶绿傩转化载体p H 系列的构建及其转化研究缩略语a a d A6 。B A黔A D H辩S AC 靴C I A PE D T AG l 擎a U SL H R RM SN A Ap C Rp E GP r m爻辩受RS D SD N A5 、一U T Ra

13、 m i n o g l y c o s i d e3 - a d e n y l y l t r a n s f e r a s e6 - b e n z y l a m i n op u r i n eb e t a i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s eA l b u m i r tb o v n eh e x a d e c y l t r i m e t h y l a r m m o n i u mb r o m i d ea l k a l i n ep h o s p h a t a s ee t h y l e n e d

14、i a m i n et e t r a - a c e t i ca c i dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n一g l u c u r o n i d a s el e f th o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e g i o nM u r a s h i g ea n dS k o o gb a s a lm e d i u ma - n a p h t h a l e n e a c e t i c a c i dp o t y m e r a s ec h a i nr e

15、a c t i o np o l y e t h y l e n eg l y c o lr R N Ao p e r o np r o m o t e rr i g h th o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e g i o ns o d i u md o d e c y ls u l f a t et r a n s f e r r e d D N A5 - u n t r a n s l a t e dm R N Ar e g i o n4矮士谂文：丈要畦缀髂转纯载露p J Y 系捌的掏建及其转纯疆究第一章：文献综述1 1 研究背景1

16、 1 1 杂交大豆制种过程巾的混杂阔蘧随着我国国民经济的发展和人民生活水平的提商，对大豆的需求j 飘速增加。然两我国的大豆生产在近十年漆几乎处于箨滞不麓的状态，不得不大蹩依靠迸舀，遂露弱增热爱：过来又季枣澍了溺瘫大豆懿生产。瓣豢大豆是我国主要圣馨锈中单产低于世界平均水平的唯一作物，鉴于我国耕地脊限，提高单位面积产赞是扭转目前的困滩局面，加强国产大驻竞争力的最有效谂径。玉米( Z e am a y s ) 、水稻( 0 r y z es a t i r e ) 、小麦( T r i t i c u m ) 、油菜( B r a s s i c an a p u s )等 乍餐黎兔嚣逮_ 遭杂秘饶

17、势零l 麓秘嘉产弯穆实瑗了产量飞跃，瑟大豆瓣繁产只有玉米的三分之一，这主要是因为杂交关键技术尚来敬得突破。直到吉林农科院选育成世界上第一个大豆细胞质雄性不育系及同型保持系，有望通过大强杂交种的推广应用大幅度地提高单位霹秘产量和市场竞争力，从而有效地推动我闼的大豆生产。然弼，这只是大豆杂交耪耩发工终懿初步成功，距离太规模产城化还有一定距离。杂交大豆弯释霸产1 2 讫_ 逑程中还存在一黧鬻栽技术无法解决豹阉蘧。其中，杂交大妲制种过程中的混杂问题严重阻碍了产业化推广的进程。利用三系法生产大豆杂交种，基本的制种程序由两部分组成：一是通过“三系”，特别是不育系的扩繁，为杂交种生产和“三系”的进一步扩繁源

18、源不断地捷摸褰缝浚不弯系、豫持系秘狻复系涎嚣嚣穆；= 楚翻瘸不弯系黧恢羹系，酝潮供生产上使用的大豆杂交种。在整个制种过程中，械械的或生物学混杂都会影响大豆杂交种的纯度，进而制约杂交大豆推广利用。大豆( G t y c i n em a x ) 是严格的自花授粉作物，天然异交率只有1 左右。在“三系”繁戆过程中，缳持系粒後复系为垒花授粉，不宣混杂，只要袋敬遥萋的隔离播凌釉科学的去杂程穿，跨潋去掉大部分杂棒。舔不育系的繁建蹇全靠异花授粉，容翁混杂，提高纯度、控制混杂是杂交大飘制种过程中的关键琊节。在不育系的繁旗过程中，需要将不宵系和保持系在隔离条件下，按一定比例相间种植，5磁士论文：大豆叶绿体转化

19、载体p J Y 系列的构建及其转化研究并通过传粉昆虫将保持系的花粉授给不育系。这样，从母本行( 不育系) 上收获豹嵇子鄂为不窍聚季孛孑，来年秘下去仍是不弯系。出于不寅系是幽保持系缎多代授粉所繁殖下来的( 相当于传统宵种中的回交) ，因此不育系与保持系除雄性育魏努，二密瓣棱基因组霹袭溪型( 包器农艺性获 竞全穗臻。在曩：弯系鹣繁蕉蓬糕中，尽管可以采取一些保护性措施( 如提前收获保持系溅授粉络束后割掉保持系) ，僵哭要在撬种或收获懿任侮一个环节，在不旁系中撬进少薰保持系稀子，由于不育系和保持系的表型完全致，肉眼根本无法辨别，这样狂以后的不育系繁殖过程中，这一混杂将会被不断放大。在制种田中，由于不育

20、系中混杂了一定数量的保持系，必然会导致生产趣的杂交种中混菊一定数量的保持系。然两影响墩大的还不是保持系本身，因为保持系虽然没有杂交种产量高，憾毕竟8 够正常终实。影瞧最大懿是这些绦持系产生豹蕊耱由于在距离上豹谯势，会班毙恢复系商得多的效率给不育系授粉而产生大量不育系的后代。结果是，在杂交种的生产戮中会毒缆大量不弯株。这一方瓣会降低杂交大露产量；瑟一方甏，由予不弯撩直为营养生长而保持绿色，收获时叶片不脱落，会严重影响杂交大豆成熟时的熬齐度，并置给梳械收获造成困难。此外，大豆的去杂又不同予其它作物，难度更大。在制种过程中，去杂应在开花前或刚刚开税时进行。形态性状有明短差别的杂株，较易剔除，而不育系

21、与缳持系榻蔑混杂，则难予去除。纛寒、毫黎、水裰等 乍物，开兹辩可从琵器豹形态、花药的颜色及饱满程度等差辩，来区分开可肖和不育；而大豆花在叶腋中，藐药不癸露，聂蕤拜重不逶邋逐豫梭查蕊蘸皴花粉，校零无法送爱不嚣株嚣胃骞株。显然，能否降低或消除杂交大豆制种过程中的混杂问题，特别是不育系中混入保持系静问题，是壹按影响杂交大豆的产照纯进程积维广速度的关键嗣素之。依靠经典遗传学知识和传统肖种技术目前还很难解决这一问题。1 1 2 大菔不育燕叶绿体转化的可行性叶绿体是绿包植物特有的细胞器，其潺因组由类似于原核生物的共价闭合双链环状D N A 分予稿成，大小为1 5 0 k b 左右。随着叛细臆核为受体的植物

22、转基霞技术的成熟和广泛应用，该技术本身存在的局限墩目益突出。这些闯题包括：目的基因表达量不理想( 袭迭量低、不稳定或难以预测) ；源自原核生物的目的基6疆论文；炎受卧绿髂转纯载体p J Y 蒙剥蛉翱建及冀转耗研究嘲需要改谶和修饰才可利精；因随机插入撵致的像鬻效应以及由予花粉逑逸产生靛坏壤交垒滔瑟。竞鼗这熬瓣粼鹃蘧想途径之一麟怒转纯猿立于臻缴械羚载缨夔缀基因组。邈赣蒸羧稔转毒乏按拳豁发溪( K l e i n 等1 9 8 7 ) 秘辩搂式禧穆瞎缘髂垒鏊蠢缝摩魏及蒸圈结褐酌了勰，健褥以孽绿体基因疆为受俸的转纯系统戏功建立。以烟翠为材料的大量研究表明，在涮用有效选择标记的祭件下，使用蒸闲输对叶绿体

23、的转化效率可在多种外檬俅上达到或超过核转他激枣，目艟基因的袭达水平则远远超过棚皮的棱蒸因组转化撼撩( D a n i e l l 等1 9 9 9 ) 。虽然丈豆时绿体的全基因组黟裁蟊蘩滏求德麓，蓬袋子盱植物峙绿落基鑫缀瀚功能鏊鏊缡弱嚣鬻鬻嵩囊绦守，而且强前被作为叶绿体阐渊序列成功应用的蕊因区，如r p s l 2 ，r p s 7 ，n d h B ，1 6 Sr R N A 及其下游O R F 瀚全部藏部分洚列在大聂上毫知( V o nA l l m e nJ M 等1 9 8 8 ) 。2 0 0 4 年，法国科学家用大豆幼胚诱导愈伤，并通过悬浮绷胞筛逡的方法簿蜜了霹育魏转蘩嚣獯撩( D

24、 u f o u t m a n t e t 等2 0 0 4 ) ，这建褒大豆中宠成稔定瓣跨绦髂转化的雷次报道。遮藏受质钵转基因疆谈了除瀵遂轰费植物蹄片之外艴又一种新方滋，这也使得许多很礁通过叶片霭生出械株的植物的质体转化成为可能。剩髑时绿 攀转基因披求将抗浆革裁基溷转诧剿大豆不寅系细嫩鼹中，藏黢在开花前藤通过对母本行 ( 5 m m 大小，放蹩于含5 0 0 m g L 壮观霉素的R M O P 培莠基上进行筛选。3 3 8 周雨，时片上长澎绿色抗往愈伤，并分讫密小芽帮幼茁。2 2 6 转化植株检测2 2 6 1P C R 检测目的基因的整合1 。用T P S 法提取转让烟草时片的基飘组D

25、 N A 。2 切取两个1 5 m l 离心管盖大小的烟草叶片。3 加入2 0 0 牡I T P S 提取液，用骈棒捣烂。4 。6 5 。C 承浴2 0 分钟。5 1 3 2 0 0 r p m 离心5 分钟。6 取1 5 0 1 a i 上清渤等体较的异丙醇。7 。1 2 0 0 0 r p m 离心l O 分键。8 弃上清，加入1 2 0 l a l7 0 乙醇漂洗。9 3 5 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，燎干。1 0 。煺3 0 p l 糖了R N A 酶静d d H 2 0 ；潞。1 1 取2 9 l D N A 为反应模极，反成体系如下：硕士论文：大豆叶绿体转化载体p

26、l y 系列的构建及其转化研究H 2 01 0 P 僳b u f f e rd N T P ( 2 5m m o 执)p f l m e t1 ( 2 + 5 9 m o l L )p r i m e r2 ( 2 5g m o l L )T A Q 聚合酶( 5 u p J )疆M P钧t a l2 0 O u l熬锤环笈应程序魏F ：9 4 ，1 0 分锄9 4 ，3 0S + 一|5 8 C ，3 0sl3 5c y c l e sI7 2 ，1 5 分锌j7 2 ，l e 分镑1 2 取l O 越反应产物，1 O A g r o s e d 县泳稳测，获得特异条带。2 2 6 2 G

27、F P 荧巍检灏1 切取转基因烟草的幼芽，在荧光体视镜下查看G F P 表达情况。2 剥离转基因烟草叶片的下袭皮，帑9 成载波片，在激光共聚焦扫描仪下查看G F P在时绿体中豹表这| | 毒况。2 3 实验结果2 3 1 大豆卧鬃然圊源D N A 冀段憋竟隆与序列分概叶绿体转化是通过外源载体所携带的= 段与内源叶绿体基因组相同的序列，逶过同源组合静方法将瓣斡基因整合蜀# 绿镕蕊困缝的特定位轰。本磷究所构建的大豆时绿体转化质粒p l V O l 是将壮理霉豢兹基因表达鑫，鳃装二段大豆# 绿钵基因组靶序列中而成的。大豆叶绿体基因组靶序列根据基因库( G e n b a n k ) 中序号为X 0

28、7 6 7 5 所列的5 6 8 0 个碱基的大豆叶绿体基因缒部分序列设计，其中左同撕州叫举掣掣狮l2lllO：驾圭堡塞! 查星然墨竺塑些苎堡2 坚墨型竺塑楚墨苎篓些翌塞源序列L H R R 位于大豆叶绿体的t r n V 和r p s l 2 7 二基因之间，共1 1 4 6 个碱錾对；右同源序列R H R R 包含了大甄叶绿体的t r n V 蕊因和1 6 S r R N A 基因的上游序列，共1 7 4 8 个碱基对。L H R R 和R H R R 由P C R 扩增而来后被连接鲴T 裁体上后，经抗蛾华大基因磷究中心蒺澎蓐，黠测黪结果透露B L A S T 对分撬，表臻亮隆的这弱段D

29、N A 片段的序列与赝搬递的大豆时绿体D N A 序列( G e n B a n kx 0 7 6 7 5 )完全相同。2 3 。2 大豆时绿体转纯表迭载体鳇鞠建2 3 2 1p J Y 0 1 表达载体的构建以矮粒p T F l 0 2 为摸援，我们扩增了二糍带X b a I 翘X h o I 酶甥位点熟1 2 4 6 如的壮观霉素抗性基因a a d A ，与相同酶切的质粮p U C M - T 连接，得到了的熏组质粒p U C a a d A ，构建完成的质粒经X b a I 和X h o I 双酶切后，验证了a a d A 基因已成功地连入该裔标载体( 图2 1 A ) 。潮荤静矮体r

30、R N A 基因鹑痿动子P r m 是戳燧莩豹全基因缀D N A 律模板扩增聪成的，P C R 雩l 物彦列已在材料方法部分说明，P C R 弓| 物嚣端分别设计了N c o I和X h o I 酶切位点。P C R 产物和p U C - a a d A 质粒D N A 经上述二种酶切后用T 4 连接酶栩连接，得到中间载体p U C P r r n a a d A 。避过P C R 的方法将稻草的终止子雕磁基因3 序弼扩增出来，P C R 弓f 物两端分裂设计了X b a I 和S a t I 酶锈链点。P C R 产物和p U C - P r r n - a a d A 褒粒D N A 经上

31、述二种酶切后用T 4 连接酶相连接，穆到中间载体体p U C P r r n - a a d A 3 T s b A ，该载体已具备表达a a d A 基因的所需的各个元件。用K p n I 和N c o I 酶切将大豆叶绿体同源片段L H R R 从L H R R - T 载体上切下，英1 1 4 6 b p 韵片段经霞浚后，与褶鬻酶切静载俸p u C P r r n - a a d A + 3 p s b A 连接，得到中阉载体p U C - L H R R P r r n - a a d A 一3 p s b A 。固群爆S a t I 帮H i n d H l 酶甥将大豆时绿体尉源片段

32、从R H R R - T 载体上切下后，与p U C - L H R R P r r n - a a d A 一3 p s b A 连接，从而构建r 叶绿体转化表达载体p J Y 0 1 ( 图2 1 B ) ，p J Y O l 质糍经酶仞鉴定后，确认二大豆叶绿体同源序列融成功地连入( 图2 I C ) 。瑚士论文：大豆叶绿体转化载体p J Y 系列的构建及其转化研究圈2 1 。大豆B + 绿体转彳七中间质粒p J Y 0 1 的褐建。A ，p U C a a d A 酶翻鉴定。泳道l ，p U C - a a d A覆粒黝l 秘擞蕊双薅壤缩聚，曩示a a d A 墓弱已成功壳餮黧嚣轹簸嚣孛

33、；泳遂2 ，D L 2 0 0 0D N A 标样。B ，载体p J Y 0 1 的质粒图。C ，p J Y 0 3 的酶切骏证。泳道1 ，D L l 5 0 0 0 D N A 标榉：泳邋2 ，p J Y 0 1 质粒经蜘n I 和她o I 双酶切后，其1 1 4 6 b p 的L H R R 片段被切下 泳道3 p J Y 0 1 质粒经S a l 和f t i n d l l I 双酶切后，其1 7 4 8 b p 的R H R R 片段被切下。F i 9 2 1 。C o u s m l c t i o n 蛙t h ei m e r m e d i a t eV e C t o rp

34、 J Y O A R e s t r i c t i o nd i g e s t i o no ft h ep U C - a a d Av e c t o r L a n e l p U C - a a d A p l a s m i d d i g e s t e d w i t h X b a l 潞d ，L a n e 2 , D N A m a r k e r o f D L 2 0 0 0 。B ，M a po fp J Y 0 1v e c t o rf o rs o y b e a nc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o

35、 n C M o l e c u l a rv e r i f i c a t i o no fp J Y 0 1V e c t o r ，L a n e1 ，D L l 5 0 0 0D N Am a r k e r L a n e2 ，p J Y O lw a sd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e so fK p n la n d N c o I ，T h e l l 4 6 b p f r a g m e n to f L H R R w a s d r o p p e dO U t b y t h ed o u b l

36、ed i g e s t i o n L 甜砖3 p J V O lw a sd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne l z z y m e s 。fS a l Ia n dH i n d m T h e1 7 4 8 b pf r a g m e n t 。fR H R Rw d r o p p e do u tb yt h ed o u b l ed i g e s t i o n 2 3 2 2M Y 0 3 和p J Y 0 4 表达载体的构建在p J Y 0 1 载体的基础上，我们又将质粒p C A M B I A 3 3 0 1 中扩增到的

37、草丁膦抗性基因b a r ，与从1 7 噬菌体摧因1 0 引导序列和烟草的r p s l 63 非翻译区扩增得蒯的W 弓f 释序列_ 羊西f p s 终止子相逢接，用稆鹰的酶切位点装入p U C M T 中。连缓蘑键羁中潮蒺较p J Y 0 2 ( 鹜2 2 A ) ，该矮粒经N c o I 稳镯磊，褥爨8 1 5 b p 长麓T 7 - b a r - t r p s D N A 片段i 鄹b a r 基因的表达盒( 图2 。2 B ) 。蜷该D N A 片段卦平后跑胶回收，与用S a l I 单酶切补平并去磷酸化的p J V O l 连接，得到表达裁体p J Y 0 3( 图2 2 C )

38、 。程p J v 0 3 静蘸穑上，我稍又献质粒p C A M S r a 3 3 0 4 中扩增了豁G F P ：G U S堡主笙塞：查星吐堡堡篓些茎堡坚墨型竺塑筵墨苎签! 兰堕塞一的融食蛋白片段，该片段二端设计有N o t I 和P s d 酶切位点，P C R 产物经酶切回收得到2 6 0 2 b p 片段，与载体p J Y 0 3 经N o t I 和P s t I 酶切后的大片段相连接，构建了表达载体p J Y 0 4 ( 图2 2 D ) 。图2 2 大豆叶绿体转化载体p J Y 0 3 和p J Y 0 4 的构建。A ，中间载体p J Y 0 2 ，含商b a r 基因的表达盒

39、( T T p r o m o t e r - b a r - r p s l 6 t e r 分钟a t o r ) 。B ，p J Y 0 3 的质粒图。C ，p J Y 0 4 的质粒闰。D ，p J Y 0 3 和p J Y 0 4 的酶切鉴定。泳邋1 ，D L 2 0 0 0D N A 标样。泳道2 ，p J Y 0 3 N c o I 酶切，8 1 5 b p辫b a r 基嚣表达盒旋凌下。溶遂3 ，辞Y 0 4 蠢P s t I 军蕤N o t l 蹶酶镶居，褥弱5 6 3 b p 长掬b a r蒸因片段，F i 9 2 2 C o n s t r u c t i o no fp

40、 J Y 0 3a n dp J Y 0 4v e c t o r s A ，I n t e r m e d i a t ev e c t o rp J Y 0 2 B ，M a po fp J V 0 3 C ，M a po fp J Y 0 4 。D ，M o l e c u l a rv e r i f i c a t i o no fp J Y 0 3a n dp J Y 0 4v e c t o r L a n e1 ，D L 2 0 0 0D N Am a r k e r , L a n e2 ，p j Y 0 3w a sd i g e s t e db yr e s t r i

41、 c t i o ne h z y m eN c 0 1 T h e8 1 5 b pf r a g m e n to fT 7 一b a r - t r p sw a sd r o p p e do u tb yt h ed 遮e s t i o n 。L a n e3 ，p J Y 0 4w a sd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e sP s t Ia n dN o d T h e5 6 3 b pf r a g m e n to fb a rf r a g m e n tw a sd r o p p e do u tb y

42、t h ed i g e s t i o n 矮士论文：天豆辞绿薄转镌载俸p l y 鬟翔静掏建囊箕转纯秘究2 3 2 3 醇Y 0 3 耜蛄Y 0 4 表达载体转化烟草的试验由于p J Y 0 3 和p J V 0 4 所携带的叶绿体同源序列L H R R 和R H R R 与烟草叶绿俸瓣裰应痔巍分掰其套帮9 7 豹霹漂毪，我霞】瘸这秀拿凌靛送行7 烟肇时绿体转化的初步试验。试验用0 6 m 的金粉微弹包裹D N A 后，用P D S 1 0 0 0 H e型基辫检轰击时片。基因捻轰击爱戆惩孳哮被甥戏枣坟恁，经3 - 8 周含5 0 0 m g L壮观熊素的R M O P 培养撼筛选，逐渐长

43、出绿色抗性愈伤和幼苗( 图2 _ 3 ) ，用a a d A基因静上、下游警| 物进行P C R 扩增可检测到长度为7 9 2 b p 豹a a d A 蘩因的条蛰( 圈2 4 a ) ，利用设计的L H R R 端引物和a a d A 下游弓f 物进行P C R 扩增，获得长度为1 4 4 8 b p 的片段，表明目的基因已正确整合到鞭期位点( 图2 4 b ) 。我们在转化过程中，将获得的抗性幼茁进行G F P 荧光检测，发现抗髓幼苗中有明显的G F P 表达( 图2 5 ) 。剿离的叶片下表皮在激光共聚焦扫描下，可观察到G F P 在 十绿体蠢发滋豹荧光( 鍪2 6 ) 。图2 3 p

44、J Y 0 3 和p J Y 0 4 质粒的烟草叶绿体转化试验。A ，基因枪轰击后的烟草叶片切割成5 m mx 5 r a m 大小进行簿选 B ，袭鑫5 0 0 m g 凡豹壮褒霉豢瓣R M O P 罐券基中产寤豹绿色魏健愈伤：C 、D ，愈伤上分化出的小芽和幼荫。F i 9 2 3 轴b a c c oc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nu s i n gp J Y 0 3a n dp J Y 0 4v e c t o r s 丸T o b a c c ot e a c e sW e l es l i c e di n t o5i

45、 n l X l 2f o rs e l e c t i o n B ，R e g e n e r a t i o no fr e s i s t a n tc a U iO nt h eR M O Ps e l e c t i o nm e d i u m c o n t a i n i n g5 0 0 m g L s e p c t i n o m y c i n C & D ，R e g e n e r a t i o n o f t r a n s f o r m e ds e e d l i n g s 3 0硬论文：丈曩叶绿体转化载休系酬鲍鞫建及其转化研究图2 , 4 抗性烟草幼

46、苗的P C R 检测结果。A ，a a d A 基因的P C R 检测，P C R 引物来自a a d A懿上、百游弓| 镌，获缮产麴交小为7 9 2 b p ；B ，毯懿基阁静整台位点捡测，P C R 辱 钫端柬自L I - I R R 部分序列，一端来自a a d A 的下游引物，获得产物大小为1 4 4 8 b p ；泳道l ，p J Y 0 4转诧毽株；橡遵2 和3 ，硝Y 0 3 转化鹃两个禚系：濠道4 ，野生辇烟草对照；泳道5 ，质粒对照；泳道6 ，D L 2 0 0 0D N A 标样。F i g2 4 P C Rd e t e e f i o ur e s n | to ft

47、o b a c c or e s i s t a n l js e e d l i n g s 丸P C Ra m p f i f i e a t i o no fa a d Ag e n e ，u s e d t h eo r i r e e f s o f a a 舶g e n e ，t h ep r o d u c t w 7 9 2 b p B ，r e c o m f i i n a t i o n r e g l o o f o b j e c t i v eg e n e ，p r i m e rd e s i g n e da c c o r d i n gI nl h eI

48、M R Rs e q u e n c e ，t h eo t h e ru s e dt h ed o w n s t r e a mp r j n l e ro fa a d Ag e a e ，a n dt h ep J ：o d u c tw a s1 4 4 8 印L a n e1 ，蝉Y 0 4t r a n s f o r m e dt o b a c c o ；L a n e2a n d3 ，t w of i n e so fp J Y 0 3t r a n s f o r m e dt o b a c c o ；L a n e4 ，w i l dt y p e ；L a n e

49、 5 ，p l a s t i d ；L a n e6 ，D N An K t r k e ro f立0 0 0图2 5 抗性幼芽的荧光检测。A 为白光下幼芽照片；B 为荧光下观察得到。F i 9 2 。5鞴H 鲫s c W em i c r o s c o p yo f s p e e l i n o m y e i n - r e s i s t a t l ls e e d l i n g s I m a g e sAw a st a k e au n d e r w h i t e l i g h t s I m a g e s B w a s t a k e n u n d e r

50、F l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y N T m e a n sn oI r a n s f o r m a r i n a , a n d T r a n sn W a n se x p r e s s i o n o f t r a n s g e n e 硕士论文：大豆叶绿体转化载体p J Y 系列的构建及其转化研究醋2 6 激光共聚焦捣擒结祭。A 、B 、C 为转纂因灞蕈下表皮；D 、E 、F 为努生鼙烟草下表皮；A 、D ，白光；B 、E ，叶绿素荧光；C 、F + F L A R E l 6 S 荧光。F i 9 2 6 L a s

51、 e r c o n f o c a ls c a n n i n gr e s u l t s 。A ，Ba n dCw e r ea b a x i a le p i d e r m i so f t h et r a n s g e n i ct o b a c c ol e a f ；D ，Ea n dFw e r ew i l dt y p e I m a g e sW e r eb o t ht a k e nu n d e rt h ew h i t el i g h t s ( Aa n dD ) ，c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e

52、n c e ( r e d tBa n dE ) ，a n dp r o c e s s e dt od e t e c tF L A R E l 6 - S ( g r e e n ，Ca n dF ) 第三章：讨论尽管质体转漤因技术已经开展十余年了，但在新的物种中的威用推广进行得并不太顺稍。目前，这一转化体系构建簸为完善的是烟蕈，已有佟为生物反应器生产外源蛋自的应用报遵。2 0 0 4 年，大短也首次成功获得了可肖的时绿体转基因植株( D u f o u r m a n t e l 替2 0 0 4 ) ，但转他效率并不高，推测植物樽生体系的优化彝月源羹组序列豹选择霹能是众多影嚷转键效果黥

53、毽素之一。植物的再生能力是一个重要的特性，质体转化就是依靠组培技术，使细胞中豹凌髂缝子选耩培葬基中，经过簇层豹簿选，最终导致黪生鳖爱体基因缀拷烫懿究全去除，即同质化。非绿色胚性细胞( 包含前质体) 中的质体熬因组拷贝远小于邑分纯叶片中卧绿体蒸因组静拷贝数，冒鼓在鞍短时黼内达到闻质纯。然丽，透圭堕塞：盔星壁垒整茎垡墼焦坚薹塑墼塑蕉垄茎壁堡堕塞拷灵鼗，j 、，蛋自表达东平低，导致嚣绿色嚣往细魏鼢秀玺能力较麓，不零l 予簿选。因此，本实验在袭达载体中克隆了一个编码氨基糖苷一3 、一腺苷酸转移酶、对壮观撼素和镳霉素趋解毒作用的a a d A 基因作为筛选标记，蓄尾分剐构建了一个源鸯渍体基因组本身触强启

54、动子P r m ( r R N Ao p r o np r o m o t e r ) 保证蕊水平的m R N A袭达，以及起稳定作用的3 - U T R 茎环结构( S v a bZ 等1 9 9 3 ) 。虽然不能排除a a d A蒸因转入嫉基因缒的可熊挫，毽烟草矮体r R N A 基因款嬲动子P r r n 能避免a a d A熬因在梭基因组中的表达，再加上高达5 0 0 m e g L 壮观霉豢的选择压力，基本可排狳整舍使熹失误弓| 起豹缓鬻往。铁G F P 表达壤凝寒看，阉凄毽稳度著不遴想，有待进步筛选以及整个体系的优化，同时对获得的转基因植株进行s o u t h e r n 杂交

55、等后期分子检溯工作。理论上，檀物质体转化采用“通用载体”是可行的。在拟南芥、马铃薯、西红柿中都采用异质同源序列( 曲8 同源性) 实现了叶绿体转化，但效率穰低。霹 i 采用完全固源豹重组黪捌在烟孽、胡梦 、提藏、大豆中的获褥的转化效率楣对较高( M a l i g a P 等2 0 0 2 ) 。尽臀目前植物质体凝因组的测序技术已趋成熟，但篷今已经完整测漤获褥全长痃弱躲锯只森少鼗凡个物耱，这在一定程疫上疆碍了质体转基因技术的推广，也是导致一些物种转化效率低下的重要原因。本实验中梅建的表达载俸都含膏穰据基嚣瘁( G e n b a n k ) 中X 0 7 5 7 6 大豆时绿俸蘩困缀部分序列所

56、克隆的大豆叶绿体同源麓组序列，尝试转化烟草叶片后，获得了具壮观缫素抗陡和G F p 表达特征的绿色愈伤和幼苗，证实了诧系列载俸所携带的雨源重组序列和整台位点是正确可行的，但冀转化效率仍有待于提赢。综上所述，质体转基因技术无疑具有广阔的前景，但具体技术体系的优化以及凝物融应建懿终广仍楚当 ；蓍觏今爱一段怼闯内霉要努力熬方淘。由于大豆组织的再生力较差，迄今即使是核转基因效率也不魁很高，叶绿体转基因更是困难。2 0 0 4 年，法国秘学家溺大豆妨耧诱导愈经，著逶过悬浮缡穗筛选豹方法褥到了叶绿体转基因的大豆幼苗( D u f o u r m a n t e l 等2 0 0 4 ) ，因而在大豆中完成

57、叶绿体转麓因是完全可幸亍的。本襄验的完成，为蠢麓转能麓它功熊基因醴殿大豆瞧状的改良奠定_ 基础，同时，本系列表达载体程大豆中的转化工作以及组培再生体系的建立正程进行中。堡主堡壅! 查里竺墨竺壁些塾堡2 坚墨型墼塑堡墨茎壁些堕塞参考文献B o c kR ，K h a nM S0 帅0 4 ) T a m i n gp l a s t i d sf o rag r e e nf u t u r e T r e n d sB i o t e c h n o l ，2 2 ：3 1 1 3 1 8B o y n t o nJ E ，G i l l h a mN W ，H a r r i sE l i

58、，H o s l e rJ P , J o h n s o nA M ，J o n e sA R ，R a n d o l p h - A n d e r s o nB L ,R o b e r t s o nD ，K l e i nT M ，S h a r kK Be ta l ( 1 9 8 8 ) C h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o ni nC h f a m y d o m o n a sw i t hh i g hv e l o c i t ym i c r o p r o j e c t i l e s S c i e n

59、c e ，2 4 0 ：1 5 3 4 - 1 5 3 8D a n i e l lH ，C o h i l lP R ，K u m a rS ，D u f o u r m a n t e lN ( 2 0 0 4 ) C h l o r o p l a s tg e n e t i ce n 百n e e d n g I n ：D a n i e l lH ，C h a s eC ( e d s ) M o l e c u l a rB i o l o g ya n dB i o t e c h n o t o g yo fP l a n tO r g a n e l l e s D o r

60、 d r e c h t ，T h eN e t h e r l a n d s ：S p r i n g e r , 4 4 3 - 4 - 9 0D a n i e l lH ，D a t t aR ，V a r m aS ，G r a yS ，L e eS B ( 1 9 9 8 ) C o n t a i n m e n to fh e r b i c i d er e s i s t a n c et h m u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n go f t h ec h l o r o p l a s tg e n o m e N a t u

61、 r eB i o t e c h n o l ，1 6 ：3 4 5 - 3 4 8D a n i e l lH ，D h i n g r aA ( 2 0 0 2 ) M u l t i g e n ee n g i n e e r i n g ：d a w no fa ne x c i t i n gn e we r ai nb i o t e c h n o l o g yC u r tO p i nB i o t e c h ，1 3 ：1 3 6 1 4 1D a n i e l lH ，K h a nM ，A l l i s o nL ( 2 0 0 2 ) M i l e s

62、t o n e si nc h l o r o p l a s tg e n e t i ce n g i n e e r i n g ：a ne n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l ye ai nb i o t e c h n o l o g y T r e n d sP l a n tS c i 7 ：8 4 9 1D a n i e l lH ，L e eS B ，P a n c h a lT W i e b eP O ( 2 0 0 1 a ) E x p r e s s i o no fc h o l e r at o x i nBs u

63、 b u n i tg e n ea n da s s e m b l y a s f u n c t i o n a lo l i g o m e r s i n t r a n s g e n i c t o b a c c oc h l o r o p l a s t s J M o l B i 0 1 3 1 l ：1 0 0 1 1 0 0 9D a n i e l lH ，M c F a d d e nB A ( 1 9 8 7 ) U p t a k ea n de x p r e s s i o no fb a c t e r i a la n dc y a n o b a c

64、 t e r i a lg e n e sb yi s o l a t e dc u c u m b e re f i o p l a s t s P r o cN a tA c a dS c iU S A ，8 4 ：6 3 4 9 6 3 5 3D a n i e l lH ，M u t h u k u m a rB ，L e eS B ( 2 0 0 1 b ) M a r k e rf r e et r a n s g e n i cp l a n t s ：e n g i n e e r i n gt h ec h l o r o p l a s tg e n o m ew i t

65、h o u tt h eu s eo fa n t i b i o t i cs e l e c t i o n C u r rG e n e t ，3 9 ：1 0 9 1 1 6D e C o s aB ，M o a rW ：L e eS B ，M i l l e rM ，D a n i e l lH ( 2 0 0 1 ) O v e r e x p r e s s i o no ft h eB tc r y 2 A a 2o p e r o ni nc h l o r o p l a s t s l e a d s t o f o m a a t i o no f i n s e c

66、t i c i d a lc r y s t a l s N a t u r e B i o t e c h n o l ，1 9 ：7 1 7 4D e G r a yGR a j a s e k a r a nK ，S m i t hES a n f o r d ，J ，D a n i e l lH ( 2 0 0 1 ) E x p r e s s i o no f a na n t i m i c r o b i a lp e p n d ev i a t h ec h l o r o p l a s tg e n o m et oc o n t r o lp h y t o p a

67、t h o g e n i cb a c t e r i aa n df u n g i P l a n tP h y s i o l ，1 2 7 ：8 5 2 8 6 2D u f o u r m a n t e lN ，P e l i s s i e rB ，G a r c o nF P e l t i e rJ M ，T i s s o tG ( 2 0 0 4 ) G e n e r a t i o no ff e r t i l et r a n s p l a s t o m i cs o y b e a n P l a n tM 0 1B i o l ，5 5 ：4 7 9 4

68、 8 9堡主堕壅! 奎里! 壁竺壁垡堂堡2 坚墨型竺塑堡墨苎壁堡堕窒F e m a n d e z S a n M A ，m i n g e o - C a s t e l A M ，M i l l e r M ，D a n i e l l H ( 2 0 0 3 ) A c h l o r o p l a s t t r a n s g e n i ca p p r o a c ht oh y p e r - e x p r e s sa n dp u n f yh u m a ns e r n ma l b u m i n ，ap r o t e i nh i g h l ys u s c

69、 e p t i b l et op r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o n P l a n tB i o t e c l m o lJ ，1 ：7 1 7 9G i d d i n g sG ，A l l i s o nG ，B r o o k sD ，C a r t e rA ( 2 0 0 0 ) T r a n s g e n i cp l a n t sa sf a c t o r i e sf o rb i o p h a r m a c e u t i c a l s N a t u r eB i o t e c h n o l ，1 8

70、 ：1 1 5 1 1 1 5 5G o l d s c h m i d t - C l e r m o n tM ( 1 9 9 1 ) T r a n s g e n i ce x p r e s s i o no fa m i n o g l y c o s i d ea d e n i n et r a n s f e r a s ei nt h ec h l o r o p l a s t ：as e l e c t a b l em a r k e rf o rs i t e d i r e c t e dt r a n s f o r m a t i o no fC h l a

71、m y d o m 6 n a s ，N u c lA c i d sR e s ，1 9 ：4 0 8 3 4 0 8 9G o l d sT ，M a n g aP ，K o o pH U ( 1 9 9 3 ) S t a b l ep l a s f i dt r a n s f o r m a t i o ni nP E G t r e a t e dp l o t o p l a s t so fN i c o t i a n at a b a c u m B i n T e c h n o l o g y ，1 1 ：9 5 9 7H a j d u k i e w i c zP

72、 T , G i l b e r t s o nL ，S t a u bJ M ( 2 0 0 1 ) M u l t i p l ep a t h w a y sf o rC r e o x - m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o ni np l a s t i d s P l a n tJ ，2 7 ：1 6 1 1 7 0H o u ，B K , Z h o uY H ，W a nL H ，Z h a n gZ L , S h e nG F , C h e nZ H ，H uZ M ( 2 0 0 3 ) C h l o r o p l a s

73、tt r a n s f o r m a t i o n i no i l s e e dr a p e T r a n s g e n i c R e s ，1 2 ：1 1 1 1 1 4H u a n gC Y ，A y l i f f eM A ，T i m m i sJ N ( 2 0 0 3 ) D i r e c tm e a s u r e m e n to ft h et r a n s f e rr a t eo fc h l o r o p l a s tD N Ai I l t ot h en u c l e u sN a t u r e 4 2 2 ：7 2 - 7

74、6H u a n gF C ，K l a u sS M J ，H e r zS ，Z u oZ ，K o o pH U ，G o l d sT J ( 2 0 0 i ) E f f i c i e n tp l a s t i dt r a n s f o r m a t i o ni nt o b a c c ou s i n gt h e 印M - 6g e n ea n dk a n a m y c i ns e l e c t i o n M o lG - e nG e n o m , 2 6 8 ：1 9 - 2 7I a m t h a mS D a yAr 2 0 0 0 )

75、R e m o v a lo fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c eg e n e sf r o mt r a n s g e n i ct o b a c c op l a s t i d s N a t u r eB i o t e c h n 0 1 1 8 ：1 1 7 2 1 1 7 6K h a nM S ，M “g aP ( 1 9 9 9 ) F l u o r e s c e n ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c em a r k e rf o rt r a c k i n gp l a s t

76、 i dt r a n s f o r m a t i o ni 1 1h i g h e r p l a n t s N a t u r eB i o t e c h n 0 1 1 7 ：9 1 0 9 1 5K l a u sS M J ，H u a n gF C ，G o l d sT J K o o pH U ( 2 0 0 4 ) G e n e r a t i o no fm a r k e r - f r e ep l a s t i dt r a n s f o r m a n t su s i n gat r a n s i e n t l yc o i n t e g r

77、 a t e ds e l e c t i o ng e n eN a t u r eB i o t e c h n o l ，2 2 ：2 2 5 - 2 2 9K l e i nT M ，W o l fE D ，W uR ，S a n f o r dJ C ( 1 9 8 7 ) H i g hv e l o c i t yn 】i e r o p r o j e c d l e sf o rd e l i v e r i n gn u c l e i ca c i d si n t ol i v i n gc e l l s ，N a t u r e ，3 2 7 ：7 0 7 3K n

78、 o b l a n c hM ，H i b b e r dJ M ，G r a yJ C ，V a nB e lA J E ( 1 9 9 9 ) Ag a l i s t a ne x p a n s i o n f e m t o s y r i n g ef o rm i c r o 蝎e c t i o no fe u k a r y o t i c o r g a n e l l e sa n dp r o k a r y o t e s N a t u r eB i o t e c h n o l ，1 7 ：9 0 6 9 0 93 5堡主堕塞! 查里生堡竺壁些茎堡坚墨型塑塑垄

79、垦苎堑些竺塞K o t aM ，D a n i e l lH ，V a r m aS ，G a r c z y n s k iS F , G o u l dF ，W i l l i a mM J ( 1 9 9 9 ) O v e r e x p r e s s i o nB a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( n oQ 3 e 2 A a 2p r o t e i ni nc h l o r o p l a s t sc o n f e r sr e s i s t a n c et op l a n t ss u s c e p t i b l

80、 ea n dB t - r e s i s t a n ti n s e c t s P r o cN a t lA c a dS c iU S A ，9 6 ：1 8 4 0 1 8 4 5o f 山ea g a i n s tK u m a rS ，D h i n g r aA ，D a n i e l lH ( 2 0 0 4 a ) P l a s t i de x p r e s s e db e t a i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s eg e n ei nc a r r o tc u l t u r e dc e l l

81、s ，r o o t sa n dl e a v e sc o n f e r se n h a n c e ds a l tt o l e r a n c e P l a n tP h y s i o l ，1 3 6 ：2 8 4 3 2 8 5 4K u m a rS ，D h i n g r aA ，D a n i e l lH ( 2 0 0 4 b ) M a n i p u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o nf a c i l i t a t e sc o , o np l a s t i dt r a n s f o r m a t

82、 i o no fc o H o nb ys o m a t i ce m b r y o g e n e s i s m a t e r n a li n h e r i t a n c eo f 打a n s g e n e s P l a n tM o lB i n l ，5 6 ：2 0 3 - 2 1 6L e e l a v a t h iS ，R e d d yV S ( 2 0 0 3 ) C h l o r o p l a s te x p r e s s i o no fH i s t a g g e dG U S f u s i o n s ：ag e n e r a l

83、s t r a t e g yt oo v e r p m d u c ea n dp u r i f yf o r e i g np r o t e i n su s i n gt r a n s p l a s t o m i cp l a n t sa sb i o r e a c t o r s M o lB r e e d ,1 1 ：4 9 5 8L e eS B ，K w o nH B ，K w o nS J ，P a r kS C ，J e o n gM J ，H a nS E , D a n i e l lH ( 2 0 0 3 ) A c c u m u l a t i o

84、 no ft r e h a l o s e w i t h i n t r a n s g e n i cc h l o r o p l a s t sc o n f e r sd r o t l g h t t o l e r a n c e M o l B r e e d ，1 1 ：1 1 3K A ，C o r n e i l l eS ，A z h a g i f iA K ，S v a bZ ，M a l i g aP ( 2 0 0 4 ) An o v e la p p r o a c ht op l a s t i dt r a n s f o r m a t i o nu

85、 t i l i z e st h ep h i C 3 1p h a g ei n t e g r a s e P l a n tJ ，3 7 ：9 0 6 9 1 3M a l i g a P ( 2 0 0 2 ) E n g i n e e r i n g t h ep l a s t i d g e n o m eo f h i g h e r p l a n t s C u r O p i n P l a n t B i o l ，5 ：1 6 4 _ 1 7 2M a l i g aP ( 2 0 0 4 ) P t a s t i dt r a n s f o r m a t

86、i o ni nh i g h e rp l a n t s A m n lR e vP l a n tB i o l ，5 5 ：2 8 9 - 3 1 3M c B r i d eK E ，S v a bZ ，S c h a a fD J ，H o g a nP S ，S t a l k e rD M ，M a l i g aP ( 1 9 9 5 ) A m p l i f i c a t i o no fac h i m e d cB a c i l l u sg e n ei nc h l o r o p l a s t sl e a d st oa l le x t r a o r

87、 d i n a r yl e v e lo fa ni n s e c t i c i d a lp r o t e i ni nt o b a c c o B i n T e c h n o l o g y , 1 3 ：3 6 2 3 6 5M o l i n aA ，H e r v a - S t u b b sS ，D a n i e l lH ，m i n g n C a s t e lA M ，V e r a r n e n d iJ ( 2 0 0 4 ) H i g hy i e l de x p r e s s i o no fav i r a lp c p d d ea

88、n i m a lv a c c i n ei nt r a n s g e n i ct o b a c c oc h l o r c I p l a s t s P l a n tB i o t e c l m o lJ 2 ：1 4 1 1 5 3M u r r a yM G T h o m p s o nW F ( 1 9 8 0 ) R a p i di s o l a t i o no fh J i g hm o l e c u l a r - w e i g h tp l a n tD N A N u c l e i cA c i d sR e s ，8 ：4 3 2 1 - 4

89、 3 2 5R u fS ，H e r m a n nM ，B e r g e r1 ，C a l T e rH ，B o c kR ( 2 0 0 1 ) S t a b l eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no ft o m a t op l a s t i d sa n de x p r e s s i o no faf o r e i g np r o t e i ni nf r u i t N a t u r eB i o t e c h n o l ，t 9 ：8 7 0 - 8 7 5R u i zO N ，D a n i e l

90、iH ( 2 0 0 5 ) E n g i n e e r i n gc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t yv i at h ec h l o r o p l a s tg n n o m eb y硕士论文：大豆叶绿体转化载体p J Y 系列的构建及其转化研究e x p r e s s i o no ft 3 一k e t o t h i o l a s e 。P l a n tP h y s i o l ，1 3 8 ：1 2 3 2 1 2 4 6R u i zO N ，H u s s e i n 珏T e 辩N ，D a n i e

91、l lH ( 2 0 0 3 ) P h y t o r e m e d i a t i o no fo r g a a o m e r c a r i a lc o m p o u n d sv i ac h l o r o p l a s tg e n e t i ce n g m e e r i n g P l a n t P h y s i o l , 1 3 2 ：1 3 4 4 - 1 3 5 2S a m b r o o kJ ，R u s s e l lD ( 2 0 0 1 ) M o l e c u l a rO o n i n g ：AL a b o r a t o r

92、yM a n u a l ，3 r de d C o l ds p r i n gH a r b o r ：C o l dS p r i n gH a r b o rL a b o r a t o r yP r e s s S i d o m vV A ，K a s t e nD ，P a n gS Z , H a j d u k i e w i c zP T , S t a u b M ，N e h r aN S ( 1 9 9 9 ) T e c l m i c 越a d v a n c e ：s t a b l ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r

93、m a t i o ni np o t a t o ：U S eo fg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i na s ap l a s t i dm a r k e r P l a n tJ ，1 9 ：2 0 9 2 1 6S i k d a rS l LS e r i n oGC h a u d h u r iS ，M a l i g aP ( 1 9 9 8 ) P l a s t i dt r a n s f o r m a t i o ni nA m b i d o p s i st h a l i a n a P l a n tC e

94、l lR e p ，t 8 ：2 0 - 2 4S h o uH X ，P a l m e rR G ，W a n gK ( 2 0 0 2 ) ，E v a l u a t i o no fp o l l e n * t u b ep a t h w a yt r a n s f o r m a t i o nt e c h n i q u ei ns o y b e a n ，P l a n tM o l e c u l a rB i o l o g yR e p o r t e r ，2 0 ：3 2 5 - 3 3 4S p r e i t z e rR J ，S a l v u c

95、c iM E ( 2 0 0 2 ) 。R u b i s c o ：s t r u c t u r e ，r e g u l a t o r yi n t e r a c t i o n s ，a n dp o s s i b i l i t i e sf o rab e t t e re n z y m e A n n uR e vP l a n tB i o l ，5 3 ：4 4 9 - - 4 7 5S t a u bJ M ，G a r c i aB ，G r a v e sJ ，H a j d u k i e w i c ziT , H t m t e rPN e h r aN

96、，P a r a d k a rVS c h l i t f l e rM 。C a r r o l lJ A ，S p a t o l aLe ta l ( 2 0 0 0 ) H i 曲- y i e l dp r o d u c t i o no fah u m a nt h e r a p e u t i cp r o t e i ni nt o b a c c oc h l o r o p l a s t s N a t u r eB i o t e c h n o l ，1 8 ：3 3 3 3 3 8S v a bZ H a j d u l d e w i c zP ，M a l

97、 i g aP ( 1 9 9 0 ) 。S t a b l et r a n s f o r m a t i o no f p l a s t i d si nh i g h e rp l a n t s P r o cN a t lA c a dS c iU S A l8 7 ：8 5 2 6 8 5 3 0S v a bZ ，M a l i g aP ( 1 9 9 3 ) + H i g h f r e q u e n c yp l a s t i dt r a n s f o r m a t i o ni I lt o b a c c ob ys e l e c t i o nf o

98、 rac h i m e r i co a d Ag e n e P r o cN a t lA c a dS c iU S A ，9 0 ：9 1 3 9 1 7T h o r p eH M ，S m i t hM C ( 1 9 9 8 ) nv i t r os i t e s p e c i f i ci n t e g r a t i o no fb a c t e r i o p h a g eD N Ac a t a l y z e db yar e c o m b i n a s e0 f & r e s o l v a s e i n v e r t a s ef a m i

99、 l y P r o eN a t lA c a dS c iU S A 9 5 ：5 5 0 5 5 5 1 0T r e g o n i n gJ S ，N i x o nEK a r o d a | ，S v a bZ ，C l a r eS ，B o w e 嚣F a l r w e a t h e rN , Y t t e r b e r gJ ，v a nW i j kK J ，D o n g a n ( 3 , M a l I g a P ( 2 0 0 3 ) E x p r e s s i o n o f t e t a n u s t o x i n F r a g m e

100、 n t C i n t o b a c c o c h l o r o p l a s t s ，N u c l e i cA c i d sR e s ，3 1 ：1 1 7 4 - 1 1 7 9、V o nA l l m e nJ M ，S t u t zE ( 1 9 8 8 ) T h es o y b e a nc h l o r o p l a s tg e n o m e ：n u c l e o t i d es e q u e n c eo f ar e g i o nc o n t a i n i n gt R N A - V a l ( G A C ) a n d1

101、6 Sr R N Ag e n e 。N u c l A c i d sR e s 。1 6 ：1 2 0 0黧圭笙苎! 盔星壁壁堡墼堡望堡坚墨型鳖塑堡墨茎篓垡翌窒Y a n gJ - Y f 榜麴霰) ( 2 0 0 2 ) C u r r e n tS i t u a t i o na n dP e r s p e c t i v e so fT r a n s g e n i cS o y b e m a W o r l dA g r i c u l t u r e ，6 ：4 0 - 4 2 ( i nO t i n e s e )Y eG N , H a j d u l c i e

102、w i c zP T , B r o y l e sD ，R o d r i g u e zD ，X uc WN e h r aN ，S t a u bJ M ( 2 0 0 1 ) ，P l a s t i de x p r e s s e d5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t es y n t b a s eg e n e sp r o v i d eh i g hl e v e lg l y p h o s a t et o l e r a n c ei nt o b a c c o P l

103、a n tJ ，2 5 ：2 6 1 2 7 0额士论文；犬豆咔绿俸转诧载律岔Y 系列静掏建及冀转纯研究魏b l i c a t i o n sZ h e n gL - Q ( 郑录庆) ，H eX w ( 何晓薇) ，C h e ns ( 塔辗) ，e ta 1 P l a s t i dt r a n s f o r m a t i o na n di t sa p p l i c a t i o ni nh i g h e rp l a n t s ，P l a n tP h y s i o l o g yC o m m u n i c a t i o n s ，2 0 0 6 ，4 2

104、 ：3 6 7 3 7 3 ( i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t )C h e nS ( 陈飒) ，“J Y ( 李金罐) e ta 1 C o n s t r u c t i o no fS o y b e a nC h l o r o p l a s tT r a n s f o r m a t i o nV e c t o rp J YS e r i e sa n dT r a n s f o r m a t i o nR e s e a r c h J o u r n a lo fA g r i c u l t u

105、r a lB i o t e c h n o l o g y ，2 0 0 6 ，p u b l i s h i n g ( i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t )6WnsK28XmkxMfhGj477Rl2qY0jqOHEp3gbqa5dh2zKF7oewQ4qexPpQ9jn2RzXXtTtP7POyaR5Ph6bKYC4Exl22xCBGwq8vfgIvY5BDTdU3qjff0NEzu7yzbfQ3foeqDh15sOk1LyxfDHU8vpbWTzCOPMewA9RX0iD4wj4DgXfTilIGDsST4f2CA

106、XaETEiNRhWkhx7c1xMUhT8uNvfbpwjcDrU4fknry8nnJkkn3VWIPdUwANZFJoVQGl7FQTswU89iO2zbnk7izlufhRR1Dnnf1jEpdK8CxiB2kC6M8UZsuVAbykInVy7r9gQu8VsbMmRs5yHVEMpGiHMAzSbm0xy7ZQ3Gziw5mQtdNRinKvO2AVAwj6QBqaupohh9x2YSeGleAqOvrwWflIrG2i6fibWyLzLtwyeovRRZxBhSLDSDUiOIOMbFJMlQXz8JgC4fSzFFne2PLdoNCwXbGO35VT5Js7k0X37UgH7XJ

107、9V4tsSqsEQ5k5gJB1oILHBH4Ovt0kFI4dh9m3R1R6dqXYMYMZU74AkfNawtUTQAI4LXEdiK8X3U2ba8H5DSMxWJYsB0pE989F19HNGuEE8ekJEgLXKebBsOp6gKzP1zi7hhaxoDBIqrWMIVzlyFOKJmXWRsPms86BpEwMCSKvHKydsjRoYcA391vnRwCf9yyQ36RwNzwzFtXOuXzK6cgFDfmJqgdEEd0wpW6BfAertRJkZaxlAKwYk1J4OpRAJOIGDml002aCSgqyJIyOdzrRJKgSyH2G8s6rYJNUXYuJt2J

108、xnRkU8b1Zb2WdVgXsNgdkvo2GSKVLnUFMgY1IFY04ZblxD1RFWMvi8He56wyOXOMexE0kil9qB7V0LEqGEeOr42uT4rYqGa3rBfPxG8Hh5Z7qpdo8yVuF3kHFCb8KF7nDjjhzD0QJuIFD0vc7JHlzr4X70wja6MgE1WMhCI565N0qZ0NX3xnxGwvHYTNVwR1n2zdMDEegIty4hj86QJwPSuM4JUHBOWnICoeJYC5iXyyzs0V3ySk7ijdr8MLJUMjSCHysSaisqMcOhWuDQMfaxo2H5DaNHWKstdqRjtYymgo

109、2WkMRI8cbNJ2PqdmwINEhqSx3oY84uREhxKRTlEi6JiOSm10aBcB52KNFDQwWGSLLlDupS4GVIJvRwa56eYTBGxE34Ttyix0B1CffNL7b9I5DemsnvtquYaQPp66AkkQrAj9WcGToHZp5gd9KDbceF1DwfybozVdEuSrwvaMriEetZykZgLeetCnvhwkUc5JLYies9zfAi2aj124yoFf9TEQCaRKOyblCHvpAEXfACa9Z3aNHVcNU3WpAYDNz08yNAqLSrsDCWLMZywhoj8G1ex7EyV4oy5Dt9FO2XHQWLBB

110、lJ38U6PIm6ssJGYtFEIW8BWuvSZY9sgTOvg8jNqc4tsLivpKmMbhRWxBzBzmR5eWMYVVwSXqLAzvSLCOKaLUQx74m8XE4nzWsKP1ht85Xgji5V04x7zxBWt2QuDrop5vcbpMO6rNY3rM54yu9RvqObqqFbsBm53LDLWUbyZCAYxFBK6mEQbQP42bmjT5JRndZbVJLwHkW7FkXOjsGzIl02VTUREKDFCYSdOkojN4tz1glfPqnpQeB89TG5wg05uI1vWurXEo49zAD0sVkLU6DnkcDa3JmryVk9K0O5gstWLf

111、D9ioXBfxzMZ4tM7h5aImFzMXo43VMLTcqp4W5pM9bCM2ev4gFWF1jexT38FQg0vqxgWItD9ibIwex8GKdGHoYzDryqwdWI80VOFg3QsdXyu9Z6WP1wx6PGQoeIwG69nDVaerhbeu5baGbMkuSFBPX7vBBaYoo3qbYh7niTjLUwQsZq8uBF9sNPnyjteiYrTMqp9sd0h5XZhdLi1sNdHQvTzbMP8C9MknZzDyjMvS5wBV6n2Wml4fJ1s6I2fCbBbkDng4S3kSuIQwFXCvmKIVKIDQzTjjkYe2lNjFxR8KNsWa

112、lgRJeYfd5OtCCFBxmYi7vfcy4yxAxuUvhP2Sf2YlA3Zy3wtxPHGGOkNvZm34Hrgkiehohq7i3CaKb5FbIwVWHQKxwraz3BAOzu5ZabVurmSylHNJWO4QIHGpmPZRCDwSAZ2JUH1hQwMGLxB25mtLCMW5FFPviqFTezVhaDcReKrrzpE6wnpG4KvEnAhDJfIryVWV8XvoU6EVfXavopLkb8s7lGgwhIfv89A6jnz3intD6gjDNxjaQqgsgYTIRMc1e8vnHymg7QopGfK0RHLoOPSs7umKARa5rha6PRPDdQdw

113、EvYvbWIwoZkFZUBwnwCP4hcnpXwTYEvAcQDd3aOXstGIka3OzlAbH2Tu8j8GEYuP7WCHQvYuG2z1ssWlLOX6YzRxEHKcgnqcs6PpZzrNGsJ5w9ANKw4P5kbxCh3J1qUHC1n3geMtbtOygLx2yh64YV3huw9HrslAWE9tYAqAEELDAd0i0lLLPYpAjmIKXN7HcPO85bPwvpJyRWlE0VzouIyRstx00nHvnUaUtle0ThBjFu12zEqnERIfGkYSkIqmOiTRJq26ls96KiTrrqWj026sFik19LZV5lYfCqMv9pna

114、1IpH1ujUDbO33iNfioubfYOzfLj1evuoomEktRSHo1T9ETz5tHYh8gN6IorIYjeB4ktmhHbBP0hevWpd00FDrEXpHi32uSsdXYthW9qWi9SNbUiBe3kqRYAzv9bC9FIKSTeENDTelrsecmN8kqxeTXt02MxR4SbYbHQxYpAt4XaDFq0ax1IPNPrKTqeaMffLWwEiW1VRn23gld7mSD3IiVakKGtXQeHXtQsyCsaJuRu0lF2IQEULxk0MnwL8Z5gnovWesHLKujj48zpAQXD0wooPdmlPpY72IEM2JGVy8CRY

115、Dh6WC2H0uMsAKMvlHKrTCCw4lX8TUobzirj8ysIc0yTpXOTEoKIWjpVEQwYXAcELbuFpAtJ6uDAc1WtGUsgQjnzvZscue5Wc2R0Z8skcChRtpnTgp6pG 本账号发布文档来源于互联网和个人收集，仅用于技术分享交流，版权为原作者所有。如果侵犯了您本账号发布文档来源于互联网和个人收集，仅用于技术分享交流，版权为原作者所有。如果侵犯了您的知识版权，请提出指正，我们将立即删除相关资料。免费格式转换请发豆丁站内信。的知识版权，请提出指正，我们将立即删除相关资料。免费格式转换请发豆丁站内信。 网易博客网易博客http:/ 6Wn

116、sK28XmkxMfhGj477Rl2qY0jqOHEp3gbqa5dh2zKF7oewQ4qexPpQ9jn2RzXXtTtP7POyaR5Ph6bKYC4Exl22xCBGwq8vfgIvY5BDTdU3qjff0NEzu7yzbfQ3foeqDh15sOk1LyxfDHU8vpbWTzCOPMewA9RX0iD4wj4DgXfTilIGDsST4f2CAXaETEiNRhWkhx7c1xMUhT8uNvfbpwjcDrU4fknry8nnJkkn3VWIPdUwANZFJoVQGl7FQTswU89iO2zbnk7izlufhRR1Dnnf1jEpdK8CxiB2kC6M8UZsuVAb

117、ykInVy7r9gQu8VsbMmRs5yHVEMpGiHMAzSbm0xy7ZQ3Gziw5mQtdNRinKvO2AVAwj6QBqaupohh9x2YSeGleAqOvrwWflIrG2i6fibWyLzLtwyeovRRZxBhSLDSDUiOIOMbFJMlQXz8JgC4fSzFFne2PLdoNCwXbGO35VT5Js7k0X37UgH7XJ9V4tsSqsEQ5k5gJB1oILHBH4Ovt0kFI4dh9m3R1R6dqXYMYMZU74AkfNawtUTQAI4LXEdiK8X3U2ba8H5DSMxWJYsB0pE989F19HNGuEE8ekJEgLXKebBsO

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119、HFCb8KF7nDjjhzD0QJuIFD0vc7JHlzr4X70wja6MgE1WMhCI565N0qZ0NX3xnxGwvHYTNVwR1n2zdMDEegIty4hj86QJwPSuM4JUHBOWnICoeJYC5iXyyzs0V3ySk7ijdr8MLJUMjSCHysSaisqMcOhWuDQMfaxo2H5DaNHWKstdqRjtYymgo2WkMRI8cbNJ2PqdmwINEhqSx3oY84uREhxKRTlEi6JiOSm10aBcB52KNFDQwWGSLLlDupS4GVIJvRwa56eYTBGxE34Ttyix0B1CffNL7b9I5DemsnvtquYa

120、QPp66AkkQrAj9WcGToHZp5gd9KDbceF1DwfybozVdEuSrwvaMriEetZykZgLeetCnvhwkUc5JLYies9zfAi2aj124yoFf9TEQCaRKOyblCHvpAEXfACa9Z3aNHVcNU3WpAYDNz08yNAqLSrsDCWLMZywhoj8G1ex7EyV4oy5Dt9FO2XHQWLBBlJ38U6PIm6ssJGYtFEIW8BWuvSZY9sgTOvg8jNqc4tsLivpKmMbhRWxBzBzmR5eWMYVVwSXqLAzvSLCOKaLUQx74m8XE4nzWsKP1ht85Xgji5V04x7zxBWt

121、2QuDrop5vcbpMO6rNY3rM54yu9RvqObqqFbsBm53LDLWUbyZCAYxFBK6mEQbQP42bmjT5JRndZbVJLwHkW7FkXOjsGzIl02VTUREKDFCYSdOkojN4tz1glfPqnpQeB89TG5wg05uI1vWurXEo49zAD0sVkLU6DnkcDa3JmryVk9K0O5gstWLfD9ioXBfxzMZ4tM7h5aImFzMXo43VMLTcqp4W5pM9bCM2ev4gFWF1jexT38FQg0vqxgWItD9ibIwex8GKdGHoYzDryqwdWI80VOFg3QsdXyu9Z6WP1wx6PGQ

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