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1、2. 1?最小致死菌量 (MLD)测定?将金葡球菌、 大肠埃希菌接种于 3ml新鲜肉汤中, 置 37? 培养 16 18h, 试验当日用含 5 %胃粘液素的生理盐水对倍稀释备用。小鼠分 8组, 每组 5只。试验大肠杆菌菌株于试验前稀释成 4. 5? 1010、 4. 5 ? 109、 4. 5 ?108及 4 . 5? 107cfu/ml4个不同浓度菌液分别给予四组小鼠腹腔注射, 每鼠 0 . 5m l 。另 4组大鼠分别腹腔注射 6. 0 ? 1010、6 . 0? 109、 6 . 0? 108及 6. 0? 107cfu/ml的金葡球菌菌液。感染后观察并记录 24h内小鼠死亡数, 以引起
2、小鼠 100 % 死亡的最低菌量 (MLD)作为体内保护试验的感染菌量5。2. 2?大肠杆菌感染小鼠保护试验?120只小鼠随机分 6组。以五淋丸 2 . 4g /kg 、1. 2g/kg 、 0. 6g /kg及 0. 3g/kg分别相当于临床剂量的 12倍、 6倍、3倍及 1. 5倍每天灌胃给药 1次, 连续 5d。诺氟沙星组于感染前和感染后 4h各腹腔注射给药 1次 ( 50mg/kg)。对照组给予生理盐水 0 . 2m l/10g体重。小鼠逐只腹腔注射 MLD大肠杆菌菌液 0 . 5m,l观察并记录感染后 7 d内各组小鼠的存活数和死亡数, 按 Bliss法运用 DAS 2. 0软件程序
3、计算其半数保护剂量 ED50及 95 % 可信区间。2. 3?金葡球菌感染小鼠保护试验 ?感染菌应用金葡球菌, 动物、 分组和给药、 观察及结果处理均同 2 . 2。3?结果? ? MLD 大肠杆菌为 4 . 5 ? 109cfu/m,l金葡球菌为 6. 0 ? 109cfu/m, l五淋丸对大肠杆菌金葡球菌感染小鼠的体内保护试验结果见表 1。? ? 表 1?五淋丸对大肠杆菌、 金葡球菌感染小鼠的保护作用组别剂量大肠杆菌 实验鼠数(只 )死亡鼠数(只 )保护率 (% )ED50( g/kg)金葡球菌 实验鼠数 (只)死亡鼠数 (只 )保护率(% )ED50( g/kg)对立? ?20200?2
4、0200? ? 五淋丸0 . 3201810?201810? ?五淋丸0 . 62014301 . 362016202 . 54 五淋丸1 . 2201240(0 . 90 2 . 05)201430( 1 . 13 5 . 73) 五淋丸2 . 420670?201050? ?诺氟沙星0 . 120290?20290? ?4?讨论? ? 本试验采用两种细菌动物感染模型, 观察了五淋丸对体内感染动物的保护作用, 结果显示该药对大肠杆菌或金葡球菌感 染小鼠均有保护作用, 为临床应用该药治疗感染性疾病提供了试验依据, 我们认为五淋丸对感染小鼠的体内保护作用可能是 由方中多种具有抗菌作用及免疫调节功
5、能的成分多方面共同作用而致。参考文献1?刘利. 八正五淋丸治疗泌尿系统感染 (附 138例报告 ). Chinese Jou-maIof Coal Industry Medicine, 2004 , 7( 8) ? 7682?王国录,刘智明. 金砂五淋丸治疗慢性前列腺炎临床总结. 陕西中医学院学报, 2005, 28( 3) ? 273?柯雪红, 方永奇, 王丽新等. 五淋丸利尿、 抗炎消肿作用的研究. 中国实验方剂学杂志, 2001, 2( 7) ? 61 62左归丸、 右归丸对衰老大鼠海马学习记忆相关基因 BDNF mRNA表达的影响戴薇薇1, 金国琴1, 张学礼1, 王亚娟1, 徐品初2
6、(1上海中医药大学基础医学院生化教研室, 上海?201203;2上海中医药大学附属曙光医院东院, 上海?201203)? 摘 ? 要 ?目的: 观察左归丸、 右归丸对衰老大鼠海马学习记忆相关基因脑源性神经营养因子 ( brain- derived neurotrophic fac - tor , BDNF) mRNA 表达的影响, 探讨老年大鼠学习记忆功能减退的部分分子机理, 以及左归丸、 右归丸的改善作用。方法: 以自然衰老 SD大鼠为动物模型, 随机分设 4组: 青年对照组、 老年对照组、 老年左归丸组、 老年右归丸组。采用原位杂交技术, 观察各组大鼠 大脑切片海马各分区 (DG、 CA1
7、、 CA2、 CA3) BDNF mRNA 表达变化。结果: 与青年对照组相比, 衰老大鼠海马各分区的 BDNFmRNA表达均明显减弱, 而左归丸、 右归丸能不同程度地提高老年大鼠海马 DG、 CA1、 和 CA3分区低下的 BDNF mRNA的表达。结论: 老年 大鼠的学习记忆功能退化, 与学习记忆相关的基因 BDNF表达异常有关。而滋补肾阴方药左归丸、 温补肾阳方药右归丸能通过提高BDNF基因的表达, 进而改善老年大鼠的学习记忆功能。 ? ? 关键词? 衰老; 左归丸; 右归丸; BDNF? ? 随着衰老, 机体各脏腑器官功能逐渐退化, 使老年人对外界环境改变的应激能力明显降低, 记忆功能
8、逐渐减弱, 许多老年14中药药理与临床 2007 ; 23( 4)性疾病如痴呆、 脑中风、 冠心病、 白内障、 骨质疏松等发病率逐渐增高。因此寻找抗衰老药物, 减少老年病的发生率, 提高生存质 量具重要的意义。本实验采用自然衰老大鼠模型, 采用原位杂交技术, 观察 经典补肾方药左归丸、 右归丸对老年大鼠海马学习记忆相关基因 BDNF mRNA 表达的影响, 以探讨老年大鼠学习记忆功能减退的分子机理, 以及补肾方药的改善作用。1? 材料与方法1. 1? 试验药物? 左归丸和右归丸取自 景岳全书 原方。左归 丸: 由熟地、 山药、 枸杞、 山茱萸、 菟丝子、 鹿角胶和龟胶组成; 右归丸: 由熟地、
9、 制附子、 肉桂、 山药、 山茱萸、 菟丝子、 枸杞、 鹿角胶、 杜仲、 当归等组成。上述药材均购自上海华宇药业有限公 司。将各方药按传统方法水煎成剂, 4? 保存备用。1. 2?动物? SD雄性大鼠, 由上海中医药大学动物中心提供。 室温 ( 22? 1)? , 光照与黑暗时间为每 12h更替。采用组间比较法分设 4组: ( 1)青年对照组, 5月龄; ( 2)老年对照组, 24月龄; ( 3)老年左归丸组, 24月龄; ( 4)老年右归丸组, 24月龄。老 年左归丸组、 老年右归丸组从 20月龄起以饮料方式分别喂左归丸、 右归丸药液, 连续 4个月, 各鼠用药剂量为 0. 75g生药 /1
10、00g 体重, 约为临床成人每公斤体重剂量的 15倍。青年对照组、 老年对照组给予正常饮水和饲料。1. 3?试剂?原位杂交保护液 (蔗糖 300g , 乙二醇 300m,l 0 . 1 M PBS 500m, l 加 DEPC水至 1000m l); BDNF原位杂交检测试剂盒(编号: MK1613)为武汉博士德生物工程有限公司产品。试剂 盒采用针对 BDNF的寡核苷酸探针, 经地高辛标记。1. 4?仪器 ?冰冻 切 片 机, 英 国 SHANDON 公 司, 型 号:AS620); 显微镜, 日本 OLYMPUS公司, 型号: CKX 41。 1. 5? 方法? 脑组织冰冻切片: 将各组大鼠
11、以 2 % 戊巴比妥钠( 40mg/kg)腹腔注射麻醉, 开胸, 在左心室插入灌注针头, 同时 剪开右心耳, 先用 300m l生理盐水冲洗, 再以 400m l多聚甲醛固定液固定, 维持 30分钟。剥取大脑, 浸入固定液 2小时, 再浸入含 30 % 蔗糖的磷酸缓冲液, 4? 保存。待大脑下沉后, 在预冷的 冰冻切片机上切片, 每片厚 30?m, 收集于原位杂交保护液中,储存于 - 20? 。原位杂交法检测海马各分区 BDNF mRNA 表 达: 按照试剂盒说明书加以改进。将切片洗涤后, 用 0. 5% H2O2去除过氧化物酶, 蛋白酶消化以暴露 mRNA, 0. 1M PBS洗涤后, 贴片
12、于 APES预处理的玻片上, 加预杂交液 40? 哺育约 3小时,加杂交液 41? 左右过夜, SSC洗涤, 滴加鼠抗地高辛, SABC, 生物素化过氧化物酶, DAB显色, 最后将切片用二甲苯透明, 中性 树脂封片。显微镜下拍摄, 采用 IPP( I mage Pro P lus)软件进行图象分析, 检测各组大鼠海马各分区平均光密度水平, 来表示mRNA 的表达变 化情况。数据统 计分析: 海马各分区 ( DG、 CA1、 CA2、 CA3)数据采用单因素方差分析 ( one way ANOVA ),用 Dunnetts post- hoc test来进行比较。2? 结果2. 1? 动物外观
13、观察? 与青年大鼠相比, 老年对照组大鼠毛发稀 落, 缺乏光泽。而两用药组大鼠毛发明显较有光泽。2. 2? 原位杂交检测结果? 见图 1 3。? ? 海马各分区 (DG、 CA1、 CA2、 CA3)分布如图所示。 BDNF表达阳性细胞胞浆呈蓝紫色, 而强阳性细胞甚至胞核亦呈蓝紫色。 青年对照组阳性细胞密集, 染色较深, 而老年对照组阳性细胞则相对稀疏, 染色较浅。? ? 表 1?左归丸、 右归丸对老年大鼠海马各分区 BDNF mRNA 表达的影响 ( ? x ? s , n= 8)组别CA1CA2CA3DG青年对照0 . 126 ? 0 . 015?0 . 120? 0 . 019?0 .
14、145 ? 0 . 021?0 . 192 ? 0 . 021? 老年对照0 . 065 ? 0 . 018*0 . 062? 0 . 018*0 . 071 ? 0 . 023*0 . 080 ? 0 . 019* 老年左归0 . 085 ? 0 . 020?0 . 082? 0 . 024?0 . 091 ? 0 . 031?0 . 134 ? 0 . 022?老年右归0 . 087 ? 0 . 019?0 . 078? 0 . 013?0 . 098 ? 0 . 016?0 . 118 ? 0 . 023? ? 与青年对照组比较 *P 0 . 05 ;与老年对照组比较 ? P 0 . 0
15、5? ? 由上图及表可见, 与青年对照组相比, 老年对照组海马各分 区的 BDNF mRNA表达明显降低; 与老年对照组比较, 补肾方 药? ? 左归丸与右归丸均能明显提高老年大鼠海马 CA1、 DG区 BDNF mRNA表达; 对于 CA3区, 右归丸作用强于左归丸; 但 对 CA2区, 老年对照组、 左归丸组与右归丸组之间无明显差别。3? 讨论? ? 自上世纪七十年代以来, 研究表明长时程突触传递增强 (LTP, long- ter m potentiation)反应与学习记忆过程关系密切,被认为是研究学习和记忆机制的主要模式。LTP的形成是神经 元突触前与突触后机制共同作用的结果, 而海
16、马是神经系统参与学习记忆形成的重要脑区 1 3。LTP可分为两个阶段, 即早期阶段 LTP( early- phase LTP , E- LTP)和后期阶段 LTP( late- phase LTP ,L- LTP) 3。LTP形成和维持过程中, 需满足突触前递质释放增加, 突触后受体有 效性增加, 突触后树突棘形态改变, 新的蛋白质合成 1 , 3。即突触前不断释放递质, 作用于突触后膜受体, 使离子通道、 酶类产 生改变, 形成 NO、 花生四烯酸等逆行信使, 后者不断向突触前 扩散而维持递质释放, 进而维持 LTP 效应。近年来认为, L -LTP形成过程中涉及到两个关键激酶 - 蛋白激酶 A ( PKA)和有 丝分裂激活蛋白 (MAPK )的活性变化, 它们可引发 L- LTP所需的基因转录和蛋白合成1。脑源性神经营养因子 ( brain- de -rived neurotrophic factor , BDNF)等是神经元和神经胶质重要的 神经营养因子。BDNF被认为是记忆形成过程中的关键蛋白之一 1 , 3, 4。BDN
