隐球菌实验室检测

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1、隐球菌的实验室检测隐球菌的实验室检测 杨启文杨启文 北京协和医院北京协和医院 IFD的诊断和治疗 2 微生物学证据微生物学证据-临床诊断临床诊断 镜检： 以下任一病灶处查见丝状菌：痰、肺泡灌洗液、支气 管毛刷、窦道析出物 培养： 以下任一病灶处查见丝状菌：肺泡灌洗液、支气管毛 刷、窦道析出物 抗原检测： G试验（血浆、血清） GM试验（血浆、血清、BALF、CSF） 3 微生物学证据微生物学证据-确诊确诊 镜检： 无菌病灶处、病理切片 培养： 以下任一无菌病灶处培养阳性：CSF、组织、无菌病 灶引流液、血 （BALF、颅窦标本、尿中培养出真菌不能确诊） 抗原检测： 隐球菌抗原 4 实验室诊断方

2、法实验室诊断方法 直接镜检+组织病理 真菌培养+鉴定 血清学 分子生物学 涂片镜检 隐球菌镜检隐球菌镜检 KOH 10-20%：皮肤标本/痰 革兰染色：多染为革兰阳性 六胺银染色 墨汁染色 真菌镜检真菌镜检 W7612 CSF W7612 CSF 墨汁染色墨汁染色， 隐球菌隐球菌 W7612 CSF 革兰染色， 隐球菌 真菌镜检 某些真菌病可通过显微镜直接检查确诊 如：卡氏肺孢子菌孢囊的检测 错误的阳性结果也会出现： 如：墨汁染色中溶解的淋巴细胞错误认 为新型隐球菌 脂肪滴容易与出芽酵母细胞混淆 10 真菌镜检真菌镜检 真菌培养 真菌培养真菌培养 12 真菌培养真菌培养- -不同接种方法不同接

3、种方法 隐球菌培养隐球菌培养 Page 14 培养基：SDA、脑心浸液琼脂 （血平皿、巧克力平皿也生长） 孵育温度：25-30度 鉴定方法：生化鉴定，质谱鉴定，基因测序 抗真菌药物抗菌谱抗真菌药物抗菌谱 15 抗原检测 IFIs血清学检测方法血清学检测方法 真菌真菌 抗原、抗体、酶、代谢产物抗原、抗体、酶、代谢产物 标本类型标本类型 真菌（除外接合 菌和新型隐球菌） (1,3)-D-葡聚糖 血清、血浆 曲霉 半乳甘露聚糖（GM） 血清、BAL （CSF?） 新型隐球菌 荚膜多糖抗原 血清、CSF 念珠菌 甘露聚糖、甘露聚糖抗体 血清、CSF 念珠菌 烯醇酶 血清 念珠菌 烯醇酶抗体、其它胞浆内

4、抗原的 抗体 血清 念珠菌 D-阿拉伯糖醇 血清 曲霉、隐球菌 甘露醇 血清 组织胞浆菌 抗原 血清、尿 G试验试验 (1,3)-D-葡聚糖 (BG) 真菌细胞壁成分 50% 广泛存在于各种 真菌，除外接合 菌 18 b1,6 glucans b1,3 PPL bilayer chitin ergosterol b1,3 glucan synthase mannoproteins G试验检测范围试验检测范围 检测底物： (1,3)-D 葡聚糖（BDG） 诊断：侵袭性真菌感染（IFI） 检测频率：2次/周 真菌细胞壁成分：念珠菌，曲霉，镰刀 菌，毛孢子菌，卡氏肺孢子菌，支顶孢 属，酵母菌属 不能

5、检测：接合菌（毛霉、根霉） 19 EORTC/MSG 2008 G试验阳性Probable invasive fungal disease 除外隐球菌病和接合菌病（毛霉、根霉 、犁头霉） De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21 G试验试验：至少连续至少连续2次检测次检测 283名血液病患者，30名AML、MDS念珠菌血症患者，30名健康志 愿者 sensitivity 97%，specificity 93% 连续2次G阳性，可提高特异性、PPV 确诊或拟诊IFI，平均比出现临床症状和体征早10d；阳性患者中 70%比临床表现早3天 21 Odabas

6、i Z , et al. Clin Infect Dis, 2004, 39: 199-205 G试验在隐球菌脑膜炎中有无诊断价值？试验在隐球菌脑膜炎中有无诊断价值？ Page 22 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 G试验诊断隐脑的性能评价试验诊断隐脑的性能评价 隐脑病人中脑脊液BDG浓度为343（200-597） pg/ml，非隐脑病人中 为37（23-46）pg/ml。 Page 23 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 不同菌量的隐脑病人中的不同菌量的隐脑病人中的G试验敏感性试验敏感性 Page 24 Rhein et al., OFI

7、D, 2014, 1-7 CSF中中BDG水平随抗真菌治疗快速下降水平随抗真菌治疗快速下降 Page 25 隐脑(-) 隐脑(+) 抗真菌治疗 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 脑脊液脑脊液BDG水平与病死率相关水平与病死率相关 Page 26 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 G试验假阳性影响因素试验假阳性影响因素方法学缺陷方法学缺陷 血液透析患者（纤维素膜） 细菌血症、肝硬化、小肠结肠炎 患者使用凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白 IV抗生素（-内酰胺类：AMC/SAM） 抗肿瘤准备：蘑菇多糖、裂褶菌多糖 手术中使用棉纱垫、棉拭子等 标本溶血、

8、脂血、黄疸 标本污染（床边消毒纱布，实验室环境粉尘） 实验耗材：所有枪头、试管、玻璃管均应无热原 G试验：小结试验：小结 泛真菌marker，无法获知是哪种真菌 高NPV，连续2次G试验阳性可提高特异性和 PPV，2次/周进行监测 IFI早期诊断 假阳性高 念珠菌定植不引起G试验升高 动态反应感染程度和抗真菌治疗疗效 抗真菌药物治疗不影响其敏感性 28 GM试验试验 诊断：侵袭性曲霉感染（IA） 检测底物：半乳甘露聚糖 曲霉细胞壁成分 菌丝在组织中生长时释放 热稳定 可溶性： serum, BAL, CSF 检测频率：2次/周 交叉反应：马内菲青霉（多种青霉、拟青霉）、深红酵母 、新型隐球菌

9、、头地霉 、顶孢霉、链格孢 、郁金香葡萄孢 、枝状枝孢霉 、多主枝孢霉 、尖镰孢 、宛氏拟青霉、产黄 青霉、指状青霉、红色发癣菌 、Wallemia sebi、Wangiella (Exophiala) dermatitisdis EORTC/MSG 2008 GM试验阳性Probable invasive fungal disease 血清、血浆、BAL、CSF De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21 GM试验假阳性试验假阳性 -内酰胺类抗菌药物：哌拉西林-三唑巴坦 免疫球蛋白、血液制品 高剂量使用激素 透析：不能清除大分子GM 化疗的严重黏膜炎的

10、患者 谷类食物中的GM抗原通过肠道入血 儿童和新生儿：假阳性83% 母乳或配方食品中双歧杆菌与GM有交叉反应 交叉反应真菌：青霉、拟青霉、隐球菌、头状地 霉、组织胞浆菌等 31 GM试验假阴性试验假阴性 抗真菌药物 三唑类降低GM水平，尤其是预防性使用 伊曲康唑 低侵袭性曲霉病 低曲霉负荷量 32 隐球菌隐球菌GM试验阳性试验阳性 Page 33 隐球菌隐球菌GM试验阳性试验阳性 Page 34 JCM，2015,43, 2929-2931 烟曲霉烟曲霉GM和隐球菌和隐球菌GalXM的分子结构的分子结构 Page 35 JCM，2015,43, 2929-2931 GM试验小结试验小结 早期、

11、快速、高特异性、高NPV GM水平反映曲霉负荷量 血清检测推荐用于恶性血液肿瘤、HSCT患者 IPA推荐同时检测BAL和血清标本 曲霉脑病可同时检测CSF和血清标本 动态变化指导抗真菌药物使用 三唑类抗真菌药的使用可能导致假阴性 结合患者临床情况进行分析！ 36 37 G+GM 种属 G GM 念珠菌属 镰刀菌属 隐球菌属 /+ 曲霉菌属 青霉/拟青霉 接合菌纲 隐球菌荚膜多糖抗原检测隐球菌荚膜多糖抗原检测 标本：血、CSF 乳胶凝集（LA）、ELISA、免疫层析 LA假阳性：低于1%。多为类风湿因子、系 统性红斑狼疮、毛孢子菌感染（抗酸杆菌个 例报道） LA假阴性：疾病早期 敏感性：93-1

12、00% 特异性：93-98% 38 隐球菌：无症状筛查隐球菌：无症状筛查 抗原血症患者随着病 程进展逐渐表现出临 床症状 CrAg阳性后平均22天 出现隐球菌脑炎症状 （5-234天） 这此期间治疗能显著 降低死亡率 Expert Opin Med Diagn. 2012; 6(3): 245-51. AIDS 2002, 16: 1031-38 CrAg试剂盒试剂盒 IMMY-LA ELISA LFA 分子生物学检测 分子分子检测检测(核酸核酸) 非扩增的核酸检测技术 PNA FISH (Yeast Traffic light, AdvanDx) 核酸扩增检测技术(NAAT) Real-ti

13、me PCR Multiplex PCR 直接测序 MALDI-TOF 质谱 (peptides) 基于核酸扩增的侵袭性真菌检测方法基于核酸扩增的侵袭性真菌检测方法 真菌类型 标本 PCR靶基因 敏感度（%） 特异度（%） 曲霉菌 肺泡灌洗液、血 18S rRNA、28S rRNA、 ITS1 55100 64100 念珠菌 血 ITS2、18S rRNA 77100 66100 肺孢子菌 肺泡灌洗液、肺组织、 痰 ITS、LSU mt、MSG 40100 59100 侵袭性真菌 血、组织 18S rRNA、ITS 75100 7098 Page 43 NAAT技术要点技术要点 因为侵袭性真菌

14、感染的标本（如血液）中的真菌含量 很低，因此，实验室采用可靠手段尽可能地裂解细胞 和提取真菌核酸对于阳性率尤其重要1。 核酸提取结束后，需要用纯化技术将可能影响PCR反 应的分子（如血红蛋白）以及可能引起交叉反应的人 类DNA去除2。 标本类型也会影响检测的敏感度。对于侵袭性念珠菌 的分子诊断，全血标本优于血清标本；而对于侵袭性 曲霉菌，全血标本和血清标本有相似的敏感度3。 Page 44 1. Burgener-Kairuz P, et al. J Clin Microbiol, 1994, 32:19027. 2. Kermekchiev MB, et al. Nucleic Acids

15、Res, 2009, 37:e40. 3. Bernal-Martinez Let al. J Clin Microbiol, 2011, 49:35969. 分子分子检测检测 分子检测目前尚未纳入侵袭性真菌感染的EORTC/MSG 原因：方法学未标准化 商业化的分子检测产品可以提供标准化的方法和试剂，从而 加速分子检测的验证过程 真菌病分子真菌病分子诊诊断的商断的商业业系系统统 检测名称检测名称 生产商生产商 检测方法检测方法 检测靶点检测靶点 标本类型标本类型 Yeast Traffic Light 美国AdvanDx公司 PNA-FISH 26S rRNA (念珠菌属) 阳性血培养液 MycAssay Aspergillus 英国Myconostica/LAB21 RT-PCR 18S rRNA (15种曲霉 菌) 肺泡灌洗液、血 清 Viracor Viracor.IBT实验室 RT-PCR 18S rRNA+ITS1 曲霉 菌属、ITS1 念珠菌属 肺泡灌洗液、血 清、血浆 Luminex xTAG ASRs 美国Luminex公司 多重PCR + 微 珠流式细胞术 23种真菌 呼吸道标本、阳 性血培养液 Fungal Assay IBIS/A